基于SSR分析的富民枳样本量对其遗传多样性指标的影响1)

张珊珊 杨文忠

(云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院)，昆明，650201)

张玉萍 高雪松 康洪梅

(昆明市濒危动植物收容拯救中心) (云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院))

基于SSR分析的富民枳样本量对其遗传多样性指标的影响1)

张珊珊 杨文忠

(云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院)，昆明，650201)

张玉萍 高雪松 康洪梅

(昆明市濒危动植物收容拯救中心) (云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院))

为了对极小种群野生植物富民枳(Ponciruspolyandra)采取合理有效的保护措施，采用SSR分子标记作为遗传完整性检测标记，研究不同梯度的有效样本量对微卫星分析中遗传多样性指标的影响。本研究利用5对SSR引物，对65份富民枳种质材料进行遗传完整性检测，并对富民枳种植资源遗传多样性的微卫星数据进行分析。结果表明：随着有效样本量的增加，有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态性信息量和Shannon信息指数等遗传指标均随之增加，有效样本量与遗传多样性指标呈显著正相关。当以有效等位基因数、多态性信息量(PI,C)和Shannon多样性指数等来衡量时，有效样本量29株为曲线的拐点，此时代表了95%以上的遗传多样性水平；而以观测杂合度和期望杂合度来衡量时，有效样本量为25株时，便达到了该总体遗传多样性水平的95%以上。综合分析表明，富民枳的有效样本量以25～29株较为合适，目前富民枳的种质保存是合理有效的。

极小种群野生植物；富民枳(Ponciruspolyandra)；遗传完整性；有效样本量；遗传多样性指标

遗传完整性指在繁殖、保存过程中要使其群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率分布及等位基因频率和原始群体一样保持不变[1]。物种保护的关键和核心问题是维持物种的遗传完整性、保持种群生存力及开展种群遗传管理等[2-4]。影响遗传完整性的因素有很多，其中样本量大小的选择尤为重要[5]。在群体遗传学研究中，合理的取样策略是研究的基础，关系到种质资源采集和生物多样性保护是否合理有效，既不浪费人力物力，又保证采集的样本能包含尽量多的遗传变异[6-7]。

分子标记分析遗传参数变化法是用来确定样本量的常用方法[5]。遗传多样性水平高低是评价各种保育措施是否有效的重要指标[8]，也为进一步探讨极小种群野生植物保护濒危机制[9-10]，制定有效的取样策略和相应的保护措施提供相应的科学依据[11-12]。Shannon信息指数(I)和多态性信息量(PI,C)是度量遗传多样性的常用指标[13-14]。赵茹等[15]用分子标记对野生大豆居群遗传多样性估算与取样策略的研究结果表明，当样本量为30～45株时，可以代表总体90%以上的遗传多样性。这与学者提出的“对于濒危物种，保持其90%以上的遗传多样性才能称之为“成功保护”[16-17]是一致的。

富民枳(Ponciruspolyandra)是芸香科枳属常绿植物，属典型的极小种群野生植物，云南特有种，调查发现已野外灭绝[18]。目前，富民枳仅以实生苗或分蘖苗保存在于种质资源收集圃，并在原分布地恢复建立了1个富民枳人工种群。但是目前富民枳的遗传完整性如何、种质保存及保护措施是否有效，都尚不清楚。

选取有效检测手段对于开展影响遗传完整性变化因素研究是很重要的工作。许多分子标记包括简单串联重复序列SSR(简单重复序列，simple sequence repeats)、SRAP(序列相关扩增多态性，sequence-related amplified polymorphism)和RAPD(随机扩增多态性DNA，random amplified polymorphic DNA)被用来研究富民枳与其近缘属植物间的亲缘关系[19-21]，但是事实证明,SSR比其他分子标记更具有更高的多态性，是研究遗传完整性的理想标记。因此，本研究采用SSR分子标记对现存的65份富民枳有效样本进行遗传多样性分析，并通过分析有效样本量对有效等位基因数、期望杂合度、多态性信息量和Shannon信息指数等重要群体遗传多样性指标的影响，以期为该物种种质保存、合理利用、有效保护以及生物多样性的研究提供理论依据。

1 材料与方法

基于前期研究基础，从昆明和富民现存的富民枳种质资源收集地共采集65份有效叶片样品，样品及其繁殖来源(实生苗或分蘖苗)都不清楚。在详细记录植株编号的同时，于2016年春季采集健康幼嫩的叶片，用硅胶快速干燥并拍照，带回实验室，用75%的无水乙醇擦拭清洗，最后用液氮冷冻贮存以备提取DNA。

DNA提取：采用改良CTAB法从叶片中提取富民枳全基因组DNA。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度法检测DNA浓度，合格样品置于-20 ℃保存备用。吸取2 mL DNA和6 mL 1×上样缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳，300 V电压下电泳12 min。

引物筛选：根据文献分析得到的STR位点引物信息，筛选出适合扩增的位点不重复的51对引物[22-23]，然后用合成的51对引物作为初筛引物，进行PCR扩增，最后对数据进行Gene mapper软件分析。根据分析结果，共筛选出5对具片段多态性的引物(表1)。

表1 引物信息及序列

在不同来源地选取一定比例的样本，用选取的不同引物进行扩增。采用15 mL体系，即2×TaqMaster Mix 7.5 mL，正向引物1 mL(10 mmol·L-1),反向引物1 mL(10 mmol·L-1),模板DNA 1 mL，灭菌ddH2O 4.5 mL。引物信息见表1，F为上游引物，R为下游引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反应程序，即94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2 μL样品+6 μL溴酚蓝)，300 V电压下12 min，获取鉴定胶图。根据胶图确定是否扩增出目的DNA片段，选取了5对扩增条带较好的引物准备二次扩增。

用带荧光染料的接头引物和正向引物对一次扩增的产物进行二次扩增，扩增体系及条件与一次相同。将上步获得的PCR产物进行电泳鉴定，获取鉴定胶图。

通过胶图确定模板浓度，加水稀释到电泳所需浓度。上机进行毛细管电泳，即按V(高度去离子甲酰胺)∶V(500 bp的内标)=130∶1配成混合液；用国产96孔反应板分装混合液，每个孔中加入10 μL；对应着在96孔板中加入0.5 μL样品模板，离心到4 000 r·min-1即停；用金属浴加热器将混合板95 ℃加热预变性5 min，拿出后立即放入-20 ℃；冷却后拿出，4 000 r·min-1离心，解冻，混匀；上3730测序仪进行毛线管电泳；获取下机结果并分析，筛选出多态性较好的位点。

用软件Gene mapper 4.1进行数据准确位点的分析，分析数据按照引物对应关系的核心碱基重复数(例如，(AG)6)片段大小263 bp(应加了M13F的18个碱基，所以大小实际为281 bp)来确定位点准确大小。根据分析出来的位点信息来判断检测引物是否具有位点多态性，选取特异性高，多态性好的位点用于最终试验测定。

数据分析：采用POPGENE Version 1.32对不同引物下的数据进行分析，计算有效等位基因数(Ne)、平均期望杂合度(He)、观测杂合度(Ho)和Shannon信息指数(I)；先根据之前的分析结果计算出各个引物的等位位点数及频率，然后利用PIC_Calc 0.6计算软件计算各引物的多态性信息量(PI,C)。对65个富民枳有效样本梯度取样，分析不同样本量组的Shannon信息指数，共取样5次，计平均值作散点图，为达到最好的回归近似，利用Origin7.0软件对有效等位基因数、期望杂合度、观测杂合度、PI,C和Shannon信息指数随有效样本量增加的变化趋势用S曲线进行拟合分析。

2 结果与分析

2.1 有效样本量对有效等位基因数的影响

从已发表文献中的51对柑橘属引物筛选出5对多态性好的SSR引物(表1)。微卫星位点的等位基因数一般较多，检测的有效样本量越大，检测到的有效等位基因数也随之增大。本研究中，不同有效样本量之间的有效等位基因数变化趋势如图1所示。有效样本量与所检测出的5个微卫星位点有效等位基因数都呈显著正相关，相关系数为0.886(表2)。其中，loci46位点检测的有效等位基因数在不同有效样本量条件下都最高，其次是loci3、loci17、loci27和loci44(图1a)。利用不同有效样本量下的5个位点的平均有效等位基因数拟合S型曲线(函数公式为y=1.925-6.14/(1+(exp(x+37.97)/12.87))(R2=0.961 9)(图1b)，结果显示，随着有效样本量的增加，有效等位基因数随之显著增加。当有效样本量等于29株时，Ne=1.89，占总等位基因数的98%，可以认为已较好反映了该物种的遗传多样性；当有效样本量小于29株时，有效等位基因数增加幅度较大；当有效样本量大于29株时，有效等位基因数随有效样本量变化的幅度较小。

表2 样本量与不同遗传参数之间的相关性

注：** 表示在0.01水平上相关性极显著(双侧检验)。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分别代表各微卫星位点；虚线代表每个位点的拟合曲线；实线代表平均有效等位基因的拟合曲线。

2.2 有效样本量对杂合度的影响

杂合度是指样本中2个等位基因不相同的概率，期望杂合度主要是根据种群内当前优势等位基因的基于频率来推算的。由图2和图3可知，观测杂合度和期望杂合度随有效样本量的变化呈现出与有效等位基因数相同的趋势。平均观测杂合度和平均期望杂合度与有效样本量之间的相关系数分别为0.901和0.897，都呈显著正相关(表2)。其中，loci27位点检测的观测杂合度在曲线趋于稳定时数值最大，其次是loci3、loci17、loci44和loci46(图2a)，拟合曲线公式为y=0.46-1.6/(1+(exp(x+22.77)/11.18))(R2=0.955 3)(图2b)；而对于期望杂合度，拟合曲线公式为y=0.49-1.52/(1+(exp(x+25.58)/10.58))(R2=0.923 9)(图3b)，loci46位点下在曲线趋于稳定时数值最大，其次是loci3、loci17、loci27和loci44(图3a)。当有效样本量超过25株后，两者数值都趋于稳定，波动较小。当有效样本量等于25株时，Ho=0.44，He=0.48。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分别代表各微卫星位点；虚线代表每个位点的拟合曲线；实线代表平均观测杂合度的拟合曲线。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分别代表各微卫星位点；虚线代表每个位点的拟合曲线；实线代表平均期望杂合度的拟合曲线。

2.3 有效样本量对多态性信息量的影响

对不同梯度有效样本量和5个不同微卫星位点下的多态性信息量进行统计分析表明，随着有效样本量的增加，PI,C逐步趋于稳定(图4)。loci27位点的多态性最低，loci46位点的多态性最高。从表2中可以很清楚地看出，平均PI,C与有效样本量成显著的正相关关系，相关系数为0.893。拟合曲线公式为y=0.38-1.52/(1+(exp(x+43.71)/15.36))(R2=0.965 6)(图4b)。与平均有效等位基因数的变化趋势一样，当有效样本量为29株时，PI,C的拟合曲线出现拐点，此时PI,C数值为0.37。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分别代表各微卫星位点；虚线代表每个位点的拟合曲线；实线代表多态性信息量平均值的拟合曲线。

2.4 有效样本量对遗传多样性指数的影响

与多态性信息量对有效样本量的响应趋势相同，遗传多样性指数也随着有效样本量的增加而升高，相关系数为0.873(表2)。loci27位点的Shannon信息指数最低，loci46位点的Shannon信息指数最高。当有效样本量为3～28株时，遗传多样性迅速增加；当有效样本量达到29株后，Shannon信息指数(I=0.691 0±0.002 0)趋于稳定，不会随着有效样本量的增加而显著增加。说明当富民枳有效样本量达到29株时，已经能够代表该物种的遗传多样性水平。根据此函数(y=0.691 67-0.062 27/(1+exp(x-16.957 44)/2.807 11)(R2=0.953 6))，当样本的Shannon信息指数达到该物种遗传多样性水平的90%(I=0.621 9)以上时，有效样本量要大于10株(n=10.696 7)。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分别代表各微卫星位点；虚线代表每个位点的拟合曲线；实线代表Shannon信息指数平均值的拟合曲线。

3 结论与讨论

有效样本量的大小会影响有效等位基因数、Shannon信息指数和期望杂合度等遗传多样性指标[23-24]。已经有研究表明，样本大小与所观测到的等位基因数和基因丰富度指数等遗传多样性指标呈显著正相关，这些遗传指标均存在随样本量的增加而随之变大的趋势[6,25-26]。在本研究中，从65份有效样本中抽取不同个体组成不同大小的样本，共34组，每组5次重复，然后分别计算每一组遗传多样性指标的平均值。结果显示，随着有效样本量的增加，有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态性信息量和Shannon信息指数等遗传指标均随之增加。

但是，应用不同的遗传指标进行遗传多样性评估时所需有效样本量不同[27]。有效样本量的确定是群体遗传多样性研究的重点[5,28-29]，过多的样本采集不仅会对有限的人力、财力和物力资源造成浪费，而且还会破坏研究对象[17]。在遗传多样性分析过程中，选择有代表性的样本量，使检测到的遗传多样性具有较高的可信性[28]，尤其在对一些濒危种群进行研究时，由于存在的个体很少，培育的苗木也很珍贵，取样数量更是受到很大的制约，因此，在开展遗传多样性研究之前，确定有效样本量十分重要。朱维岳等[30]研究大豆采样策略时发现，当以期望杂合度、Shannon多样性指数等来衡量时，样本量为27株便可达到该居群总体遗传多样性水平的95%。而以等位基因数来衡量时，需要样本量达到52株。本研究中，由5种遗传指标与样本量回归拟合结果图中的回归拟合曲线可以看出，当以有效等位基因数、多态性信息量(PI,C)和Shannon多样性指数等来衡量时，有效样本量29株为曲线的拐点，此时代表了95%以上的遗传多样性水平；而以观测杂合度和期望杂合度来衡量时，有效样本量为25株时，便达到了该总体遗传多样性水平的95%以上。这符合了Marshall et al.[31]提出的取样策略。综合理论推导和本研究的结果表明，不管是完善富民枳种质保存地的资源配置，还是构建人工重建的种群，有效样本量以25～29株较为合适。因此，目前对富民枳开展的种质保存工作基本维持了该物种的遗传完整性，开展的保护工作是合理有效的。

富民枳幼苗培育、种质资源保存和种群保护的指导建议：在现有种质资源的基础上，采集包括足够有效样本量(25～29株)的繁殖材料，进行种子繁殖和扦插繁殖试验，探索扩繁技术，扩大种苗供给能力；从65株有效样本中选择精选植株(或其复本)进行搭配，在保证有效样本量的前提下，建立新的种质资源保存地；在天然种群邻近区域，利用之前利用有效样本量(25～29株)的繁殖材料培育的幼苗，逐年回归种植富民枳苗木，新建立天然种群2～3个。

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EffectsofPonciruspolyandraSampleSizeonGeneticDiversityIndexbySSRMarkers//

Zhang Shanshan, Yang Wenzhong
(Yunnan Provincial Key Laboratory for Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, P. R. China);
Zhang Yuping, Gao Xuesong
(Kunming Endangered Animal and Plant Asylum Save Center);
Kang Hongmei
(Yunnan Provincial Key Laboratory for Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：35-39,44.

Plant with extremely small populations;Ponciruspolyandra; Genetic integrity; Effective sample size；Genetic diversity index

S722.8

1)国家自然科学基金项目(31460119和31660164)、科技基础资源调查专项(2017FY100102)。

张珊珊，女，1984年10月生，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院)，助理研究员。E-mail：zhang_ssl012@163.corn。

杨文忠，云南省森林植物培育与开发利用重点实验室(云南省林业科学院)，研究员。E-mail：wzyang2004@126.com。

2017年4月7日。

责任编辑：任 俐。

In order to take reasonable and effective protection ofPonciruspolyandra, SSR markers was used as genetic integrity detection markers to study effective sample size of different gradient on genetic diversity index in microsatellite analysis. Five pairs of SSR primers were used to detect the genetic integrity of the 65 germplasm resources, and to analyze the genetic diversity of the germplasm resources. Results demonstrated that the effective sample size had significant positive correlation effects on genetic diversity index (effective number of alleles, observed heterozygosity, expected heterozygosity, polymorphic information content and Shannon’s information index) ofP.polyandraand the genetic diversity index increased with the increase of the effective sample size. When the effective number of alleles, polymorphic information content (PIC) and Shannon’s information index were measured, the effective sample size was 29, which represented more than 95% of the level of genetic diversity. When the effective sample size was 25, the total genetic diversity level was above 95%. The comprehensive analysis showed that the effective sample size of 25-29 was more suitable, and the germplasm conservation ofP.polyandrawas reasonable and effective.