RNAi干扰联合化疗对人喉鳞癌裸鼠移植瘤STAT3信号传导通路的阻滞作用

郭 慧,倪志海,李东波,秦 多,杜 波

( 1. 大连大学附属新华医院,辽宁 大连116021；2.吉林大学白求恩第一医院 耳鼻喉科)

RNAi干扰联合化疗对人喉鳞癌裸鼠移植瘤STAT3信号传导通路的阻滞作用

郭 慧1,倪志海1,李东波1,秦 多1,杜 波2*

( 1. 大连大学附属新华医院,辽宁 大连116021；2.吉林大学白求恩第一医院 耳鼻喉科)

目的利用人喉鳞癌裸鼠癌移植瘤，研究RNAi干扰协同化疗对移植瘤中STAT3信号转导通路的影响。方法建立喉鳞癌裸鼠模型：选择Balb/c纯系裸鼠，在裸鼠的背部注射0.2 ml 2×106喉癌细胞，移植瘤直径达到9-11 mm时，实验分组：Ⅰ重组载体+顺铂组；Ⅱ重组载体组；Ⅲ顺铂组；Ⅳ 阴性对照组，3周后处死实验鼠，利用电子显微镜、流式细胞仪，研究移植瘤抑制、Hep-2细胞凋亡及STAT3信号传导通路相关调控蛋白的变化情况。结果实验鼠皮下注射Hep-2细胞后，约1个月移植瘤直径约11 mm。成瘤达到97.34%，病理显示：移植瘤(鳞状细胞癌、中分化)。电镜下：重组载体+顺铂组中的喉癌细胞核膜锐利凸起，细胞核中染色质高密度浓集，近C型改变，微量细胞膜圆形肿胀。线粒体水肿，粗面内质网脱颗粒，嵴无规则排列，或者消失。免疫组化结果：细胞浆中见到高表达染色成棕褐色物质的STAT3，细胞核中可见棕褐色点状沉积的p-STAT3。Ⅰ实验组STAT3、p-STAT3蛋白表达明显减弱，其灰度值明显低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05)。流式细胞仪显示Ⅰ实验组中STAT3、p-STAT3、Bcl-2、CyclinDl蛋白表达显著减低，大大低于另外三组，(P<0.05)。结论通过对活体裸鼠喉癌移植瘤模型的实验研究，验证了应用RNAi沉默STAT3基因对喉癌化疗的增敏作用。

RNA干扰；喉鳞癌裸鼠模型；信号转导转录激活因子3；增敏；化疗

(ChinJLabDiagn,2017,21:1414)

研究显示，在喉癌中信号转导与转录激活因子3(STAT3)基因异常表达有关[1-3]。另有证据显示，持续高水平活化的STAT3与化疗耐药性密切相关[4]。所以，抑制STAT3活化是一个理想的基因治疗靶点，可以通过阻断STAT3信号传导通路，实现减少肿瘤细胞分裂，促进细胞凋亡发生，加强肿瘤细胞对化疗的敏感性，从而达到治疗肿瘤的目的。通过前期工作我们发现，RNAi沉默STAT3基因可以提高化疗疗效，下调STAT3基因可以在活体外影响STAT3信号传导通路蛋白p-STAT3、 Bcl-xl、CyclinDl的表达，可以提高喉癌细胞对化疗药物的敏感性[5]。本实验通过RNAi沉默裸鼠人喉鳞癌移植瘤STAT3基因表达，进一步研究STAT3基因的靶向抑制与化疗敏感性之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

本实验室构建STAT3重组载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA， DNA测序鉴定。RPMI1640培养基，脂质体Lipofectamine TM 2000，磷酸化STAT3兔抗人单克隆抗体、Cyclin D1蛋白多克隆抗体、B淋巴细胞2(bcl-2)鼠抗人单克隆抗体。

1.2 实验方法

1.2.1 基因转染裸鼠转移瘤联合化疗进行治疗 健康纯种BALB/c裸鼠购于北京大学医学部动物实验中心， 3-4周龄，重13-19g，雌性，无特定病原体(SPF)环境下培养，取对数生长期的Hep-2细胞约0.2 ml注射于各裸鼠颈背部，移植瘤直径达9-11 mm时随机分组， 8只一组：Ⅰ 重组载体+顺铂组；Ⅱ重组载体组；Ⅲ 顺铂组(Cisplatin)；Ⅳ 阴性对照组(Control)。 每次Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组分别注射重组载体、阴性对照质粒20 μg/只,肿瘤分散注射，间隔3天注射一次，共8次；隔日Ⅰ、Ⅲ组分别注射顺铂2 mg/kg，注射3周后将实验鼠脱颈处死，常规处理移植瘤，观察和检测。

1.2.2 病理检查 将移植瘤固定于4%甲醛溶液中，石蜡包埋、切片、片厚4 μm，HE染色，病理性质确定。

1.2.3 超微结构的观察 处死实验鼠，取1 mm3的组织置于4%戊二醛，4℃，1 h。 0.1M磷酸缓冲液(PBS)清洗。1%锇酸，4℃，2 h。 乙醇梯度脱水；100%丙酮脱水。 丙酮、树脂的混合液浸透15 min，纯树脂浸透30 min。 样品放于包埋板中， 置于37℃、45℃、60℃的烤箱中，分别24 h。做成50 mm的超薄切片。醋酸铀30 min和柠檬酸铅30 min双重电子染色，观察、照像。

1.2.4 流式细胞术检测STAT3及相关调控蛋白的改变 治疗结束后分别取四组荷瘤小鼠的移植瘤组织约100 mg，剪碎瘤组织，轻搓组织块。300目铜网过滤，收集细胞悬液，离心， PBS清洗,冰浴避光40 min，离心5 min，弃上清； PBS清洗，离心，4%多聚甲固定；培养液重悬，冰浴、 离心，依次加入Stat3、P- Stat3、 Bcl-2、CyclinDl鼠抗人单克隆抗体相对应的一抗； 冰浴10 min后，离心、 清洗，加入二抗； 避光冰浴、清洗、离心，流式细胞仪检测。

1.2.5 统计学方法 Microsoft Excel软件处理数据，应用 SPSS19.0统计软件分析数据。组间两两比较采用LSD- t检验(方差齐)或者Dunnett T 3(方差不齐)，多组间比较采用单因素方差变量分析， P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 喉鳞癌裸鼠模型的建立

注入0.2 ml 2×106Hep-2细胞后，3天后实验鼠背部出现肿瘤生长，约1个月余肿瘤直径达11 mm左右，成瘤率97.34%。

2.2 应用RNAi沉默STAT3基因协同化疗对肿瘤的影响

2.2.1 病理学结果(HE) 病理示中分化鳞状细胞癌，重组载体+顺铂组肿瘤中央呈现较大的坏死组织和细胞。(见图1)

图1 病理结果(×100)

2.2.2电镜超微结构观察结果 重组载体+顺铂组电镜下见凋亡现象：(低倍)喉癌细胞核膜有的锐利凸起，有的篮球性胀大，细胞核染色质或高密度浓缩于核膜一边，或C型改变，(高倍)可见线粒体空泡样改变，部分水肿，嵴呈不规则改变或者彻底消失，粗面内质网明显脱颗粒现象(见图2)。

阴性对照组：(低倍)见细胞呈椭圆形改变，含有丰富的细胞质，细胞核排列极度不规则，异染色质少，常染色质丰富，核仁大而明显。(高倍)线粒体部分空泡化，粗面内质网少许脱颗粒现象(见图2)。

图2 电镜检查结果

2.2.3RNAi沉默STAT3基因联合化疗对STAT3、p-STAT3及其相关调控蛋白的表达影响a.免疫组化PV法染色显示：胞浆见到棕褐色颗粒浓染、高表达的STAT3蛋白，细胞核内见到棕褐色颗粒样沉积p-STAT3。重组载体联合顺铂组STAT3、p-STAT3蛋白表达强度大大降低，其灰度值STAT3(32.67±3.68)、p-STAT3(24.89±3.78)明显低于其余治疗组(F=13.23，F=11.24，P<0.05)(见图3-4)。

图3 瘤组织中Stat3的表达

b.流式细胞仪检测结果显示：重组载体加顺铂组STAT3、p-STAT3、Bcl-xl与CyclinD1的蛋白表达最低，其相应荧光指数(1.321±0.134，1.278±0.197，1.198±0.123，1.123±0.234)明显低于另外三组，差异均有统计学意义(F=4.23，F=2.34，F=3.78，F=2.18，P<0.05)。

图4 瘤组织中 p-STAT3的表达

3 讨论

因为低氧、阻滞细胞周期、抑制细胞凋亡等原因引起细胞生存环境发生改变，常导致以喉癌为代表的实体肿瘤对化疗不敏感。研究显示，肿瘤化疗耐药的机制之一是肿瘤细胞对凋亡的耐受，细胞凋亡因子(如Bcl-2蛋白)的高表达，可以减低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，控制肿瘤细胞凋亡；另一方面肿瘤细胞周期调控机制被破坏，而导致出现失控性增殖。

故通过使细胞周期阻滞于某一特定时刻而诱导细胞凋亡，可以达到治疗肿瘤的目的。将很少量的某物质与化疗药物联合使用可以提高化疗药物如顺铂的疗效叫做化疗增敏或者化疗耐药逆转，这种物质叫做化疗增敏剂[6,7]。资料显示，基因治疗药物属于化疗增敏剂之一，大大减少化疗毒性，改善患者化疗后的生命体征。

STAT3经典的激活方式是肿瘤细胞在生长因子或细胞因子作用下，受体被二聚化，存在于受体内部的酪氨酸激酶被激活，酪氨酸(位于STAT3第705位)磷酸化后形成二聚体，二聚体进入细胞核调控基因转录[3-5]。资料显示阻滞STAT3信号传导通路中p-STAT3、Bcl-2、Cyclin D1 蛋白的表达，可以提高肿瘤细胞化疗的敏感性，防止DNA受损，加强DNA损伤后的恢复。

如何测定某些抗癌药物是否敏感，人们常用体内和体外两种方法。体内方法，常采用移植瘤的模式，因为移植瘤可以模拟体内肿瘤细胞的生存内环境，观察到药物在移植瘤内的物质代谢过程；同时因为移植瘤具备了癌细胞本身的分裂增殖方式、三维空间立体构象、细胞膜本身的渗透压、解离度、溶解度、表面张力等因素，能比较准确地反映肿瘤对化疗药物的耐药或者敏感情况。

实验中实验鼠背部注射喉癌Hep-2细胞后，近一个月长成直径11 mm的肿瘤，给予重组载体和顺铂治疗后，病理检查移植瘤为中分化鳞状细胞癌，表明裸鼠移植瘤模型构建成功。将重组载体和顺铂联合作用于移植瘤后，裸鼠移植瘤未出现明显的毒性反应。电镜超微结构观察到肿瘤细胞出现明显的凋亡征象：重组载体+顺铂组的喉癌细胞大部分细胞核膜锐性凸起，细胞核染色质呈现高密度，边集于核膜下，形成新月形，另外还有一部分细胞膜圆形膨大，说明应用RNA沉默STAT3基因协同化疗，可明显阻滞细胞周期进行，抑制DNA合成，细胞被阻滞于G0/G1期，大大限制了喉癌裸鼠移植瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，进而增强了化疗药物的治疗肿瘤作用。

重组载体联合顺铂作用于移植瘤1天后，免疫组化PV法染色显示：STAT3于胞浆中高表达，胞浆中见有棕褐色颗粒浓染，p-STAT3于胞核中表达，胞核内可见棕褐色颗粒沉积，重组质粒载体+顺铂组 STAT3、p-STAT3蛋白表达受到了明显抑制，流式细胞仪检测结果显示重组载体联合顺铂组STAT3及其相关调控蛋白p-STAT3、CyclinDl、Bcl-2蛋白表达强度明显降低，其蛋白荧光指数与其他三组均存在差异，有统计学意义(P<0.05)。这些结果提示联合应用化疗及RNAi干扰技术可阻断抑制STAT3信号传导通路相关调控蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤对化疗药物的敏感性。导致这一结果的原因一方面是因为顺铂直接作用于肿瘤细胞，造成肿瘤细胞坏死，另一方面RNAi沉默STAT3基因，抑制了肿瘤细胞的生长，诱导其凋亡。

综上所述，本次通过对裸鼠喉鳞癌移植瘤模型的研究，从体内客观验证了应用RNA干扰STAT3基因可提高喉癌对化疗药物的敏感性，为肿瘤研发新的联合治疗方案提供理论和实验基础。增加化疗药物的疗效，减少其毒副反应是治疗肿瘤的原则之一，加快化疗增敏剂的开发和研究及使用将会为肿瘤治疗带来新的希望。

[1]Yuan J,Zhang F,Niu R.Multiple regulation pathways and pivotal bio logical function of STAT3 in cancer[J].Scientific report,2015,5:17663.

[2]Yu H,Lee H,Herrmann A,et al.Revisting STAT3 signalling in cancer:new and unexpected biological functionc[J].Nat Rev Cancer,2014,14(11):736.

[3]Geiger JL,Grandis JR,Bauman JE.The STAT3 pathway as a therapeutic targer in head and neck cancer:Barries and innovations[J].Oral oncology,2016,56:84.

[4]Liu A,Liu Y,Jin Z,et al.XZH-5 inhibits STAT3 phosphorylation and enhances the cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in human breast and pancreatic cancer cells [J].PLoS One,2012,7(10):e46624.

[5]郭 慧，高 伟，秦 多，等.RNAi干扰Stat3基因诱导喉癌顺铂耐药细胞凋亡及对Stat3信号转导的影响[J].中国实验诊断学，2017，21(5):873.

[6]Abdiryim Y,Halmurat U,U mar A,et al.Cytotoxicity of Abnormal Savda Munziq aqueous extract in human hepatoma(HepG2) cells[J].Fundam Clin Pharmacol,2005,19(3):1.

[7]Abdiryim Y,Halmurat U,Umar A,et al.Protective effects of Munziq and Mushil of Abnormal Savda to mitochondrial oxidative damage [J].Fundam Clin Pharmacol ,2004,18(4):471.

TheinfluenceofRNAisilencecombinedchemotherapyforSTAT3signalingpathwaysinnudemicetransplantationtumor

GUOHui,NIZhi-hai,LIDong-bo,etal.

(DalianUniversityaffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

ObjectiveBy using Human laryngeal squamous carcinoma nude mice transplantation tumor model,to study the influence of RNA interference in combined chemotherapy for nude mouse transplantation tumor STAT3 signal transduction pathway.MethodsEstablish laryngeal squamous carcinoma in nude mice model:choose pure Balb/c nude mice,in the back subcutaneous injection of 0.2 ml 2×106hep- 2 cells,when the tumor will be 9-11 mm long,study groups:ⅠRestructuring carrier + cisplatin; ⅡRestructuring carrier group; ⅢThe negative control group; ⅣCisplatin group,chemotherapy the nice will be treated on execution after 3 weeks, the tumor suppressor ,tumor cell apoptosis and changes of STAT3 signaling pathways regulatory proteins will be observed by flow cytometry and electron microscope.ResultsAfter injection of laryngeal cancer cells,experimental mice grown to 11 mm size long by nearly one month .Tumor rate was 97.34%,pathologic examination:intermediate differentiation,squamous cell carcinoma.Electron microscopy results :Restructuring carrier + cisplatin group of laryngeal cancer cells in the nuclear membrane sharp protuberance,chromatin in the nucleus of high concentration,nearly C type change,trace round cell membrane swelling.Mitochondria edema,rough endoplasmic reticulum degranulation,crest arrangement without rules,or disappear.Immunohistochemical method showed that:Meet high expression in cytoplasmic staining into brown substances of STAT3,seen in the nuclei brown dot sedimentary p-STAT3.ⅠSTAT3,p-STAT3 protein expression decreased significantly,the grey value significantly below Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ group (P<0.05).Flow cytometry instrument displayⅠ STAT3 ,p - STAT3,Bcl - 2,CyclinDl protein expression significantly lower in the experimental group,much lower than the other three groups,(P<0.05).ConclusionIt is demonstrated that applying RNAi to silence STAT3 gene can enhance chemosensitivity by studying therapeutical effect of human laryngeal squamous carcinoma in nude mice.

RNA interference； laryngeal squamous carcinoma in nude mice mode；signal transduction and activators of transcription 3 (STAT3); Sensitization; chemotherapy

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1414-04

R739.65

：A

2016-12-19)