脑缺血再灌注后突触后膜NMDA受体重塑性机制的研究

周海霞，李朝晖，赵景伟*

(吉林大学中日联谊医院 1.VIP病房；2.神经外科，吉林 长春130033)

脑缺血再灌注后突触后膜NMDA受体重塑性机制的研究

周海霞1，李朝晖2，赵景伟2*

(吉林大学中日联谊医院 1.VIP病房；2.神经外科，吉林 长春130033)

目的探讨脑缺血再灌注后神经元突触后膜NMDA受体发生迁移重塑的机制。方法实验使用脑缺血再灌注Wistar大鼠模型，分为无缺血再灌注对照组(Ctrl)，缺血再灌注0.5 h组(I/R-0.5 h)，缺血再灌注4 h组(I/R-4 h)，缺血再灌注24 h组(I/R-24 h)。再灌注时间达到后将脑组织取出，并制成脑组织匀浆液(HOM)，利用差速离心法分离突触后膜组分(SYN)和突触外膜组分(EXTRA)，通过Western Blot分析Src蛋白激酶的表达分布及NMDA受体NR2A和NR2B的表达分布。结果Western Blot分析发现，脑缺血再灌注0.5 h后，突触后膜组分Src蛋白激酶出现超激活状态(P<0.01)，NR2A和NR2B在突触外膜组分中的表达显著降低(P<0.01)，而NR2A和NR2B在突触后膜组分中的表达升高(P<0.05)；在再灌注4 h后，Src蛋白激酶激活程度更加明显(P<0.01)，NR2A和NR2B在突触外膜组分中的表达仍显著下降(P<0.05)，但NR2A和NR2B在突触后膜组分中却出现不同程度的下降。结论脑缺血再灌注后神经元突触后膜出现Src蛋白激酶超激活状态，并介导NMDA受体NR2A和NR2B的表达分布出现重塑性，NMDA受体从突触周膜向突触后膜转移聚集。

缺血再灌注；Src蛋白激酶；NMDA受体；机制

(ChinJLabDiagn,2017,21:1423)

缺血性脑血管病占脑血管疾病80%-85%，在中老年群体中致死率和致残率很高，随着国内医学诊疗技术的明显改善提高，血管搭桥外科手术治疗及血管内溶栓治疗等技术的开展，缺血性脑血管病患者得到有效的治疗[1]，但患者一旦发生缺血性脑卒中，由其引起的神经功能障碍却很难完全恢复，究其原因在于脑组织缺血再灌注后神经元仍会发生延迟性死亡，导致临床上的神经功能障碍[2]。研究发现脑缺血再灌注时Src蛋白激酶介导并强化NMDA受体活性在神经元延迟性死亡中发挥重要作用[3]，但其中的机制仍不清楚。本实验主要探讨脑缺血再灌注后神经元突触后膜NMDA受体发生重塑性的机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

成年雄性Wistar大鼠、呼吸机、麻醉机、显微手术器械均来自美国Charles River实验室，电泳仪、超声仪、蛋白浓度测定试剂盒来自美国Bio-rad公司，抗Src-P(Y416)抗体、抗Src-P(Y527)抗体、抗NR2A抗体、抗NR2B抗体、anti-rabbit二抗均来自美国Calbiochem公司，显影液来自美国Kodak公司。

1.2 制作大鼠脑缺血模型手术方法

Wistar大鼠实施麻醉后，分离尾动脉，并从尾动脉注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素，然后分离双侧颈总动脉、分离右下肢股动脉，回抽血液至Wistar大鼠血压降50 mmHg时，以动脉瘤夹夹闭双侧颈总动脉。至此，大鼠出现全脑缺血，控制缺血时间为10 min。缺血结束后，将抽出的血液回输，缝合手术切口。

1.3 实验分组及脑组织的分离方法

根据再灌注时间将实验分为无缺血再灌注对照组(Ctrl)，缺血再灌注0.5 h组(I/R-0.5 h)，缺血再灌注4 h组(I/R-4 h)，缺血再灌注24 h组(I/R-24 h)。大鼠缺血再灌注到达时间点后将大鼠再次麻醉、气管插管，以3%的异氟烷浓度维持麻醉；切开头顶部皮肤，在切口中放置试管，将液氮反复灌注到试管中，使大鼠在活体麻醉状态下极速冷冻脑组织；随后将脑组织完整凿出，放置于液氮中储存备用。

1.4 差速离心法

在液氮环境快速分离出丘脑背外侧皮层脑组织，按照重量比1∶10加入匀浆缓冲液，匀浆器抽压35次，制成脑组织匀浆液(Homogenate,HOM)，随后在4℃ 条件下10 000 g离心10 min，去除上清，向沉淀部分中加入10倍体积的匀浆缓冲液，超声击打三次，每次5秒，然后在4℃ 条件下18 000 g离心20 min，沉淀部分即突触后膜组分(Synaptic membrane fraction,SYN)，上清部分为突触外膜组分(Extrasynaptic membrane fraction,EXTRA)。

1.5 Western blot检测

神经元组分总蛋白提取采用RIPA裂解液进行，总蛋白应用BCA法检测蛋白浓度，水浴5 min，常规电转至PVDF膜上，4℃下封闭过夜，室温TBST洗涤3次，一抗2 h， TBST洗涤3次，二抗孵育2 h后漂洗，应用二氨基联苯胺进行显色。

1.6 统计学分析

采用SPSS 18.0软件和Graphpad Prism 5.0软件对数据进行统计分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为有差异统计学意义。

2 结果

2.1 脑缺血再灌注后神经元Src蛋白激酶表达分布脑 组织匀浆后，将HOM采用差速离心的方法分离成SYN组分和EXTRA组分，Western Blot结果显示同对照组比较，在SYN组分中，Src-P(Y416)的表达在I/R-0.5 h组中显著增高(P<0.01)，I/R-4 h组达到高峰(P<0.01)，在I/R-24 h组出现下降趋势；在EXTRA组分中，Src-P(Y416)也是在I/R-0.5 h组显著增高(P<0.05)，其后逐步下降。相反，Src-P(Y527)在SYN组分中的表达在I/R-0.5 h组中显著下降(P<0.01)。由于Y416增强Src蛋白激酶活性，Y527抑制Src蛋白激酶活性；因此，这些结果提示，脑缺血再灌注后突触后膜Src蛋白激酶呈超激活状态。见图1。

2.2 脑缺血再灌注后神经元NMDA受体表达分布 Western Blot分析NMDA受体亚基NR2A和NR2B的表达分布，结果显示I/R-0.5 h组NR2A在EXTRA组分中的表达显著降低(P<0.01)，随后I/R-4 h组和I/R-24 h组NR2A表达也出现明显下降(P<0.05)；与NR2A相似，NR2B的表达分布在EXTRA中显著降低(P<0.01)；而在SYN组分中，NR2A和NR2B的表达分布在I/R-0.5 h组出现升高(P<0.05)，而在I/R-4 h组及I/R-24 h组中NR2A和NR2B却出现不同程度的表达下降，其中I/R-4 h组NR2B表达下降具有统计学意义(P<0.05)，以上结果提示脑缺血再灌注后NMDA受体从突触周膜向突触后膜转移聚集。见图2。

3 讨论

脑缺血卒中患者经治疗后缺血脑组织再灌注出现神经元延迟性死亡并严重影响生活质量及生命安全，其内在的分子机制仍不明确。NMDA属于谷氨酸离子型受体，是介导神经毒性最主要的受体[4]。NMDA在中枢神经系统中参与突触后膜兴奋性神经递质谷氨酸介导的突触后信号传递，而NMDA受体过度或持续激活可导致的细胞内Ca2+超载，所产生兴奋性神经毒作用，可引发缺血性脑损伤、中风、癫痫等病理状态下神经元死亡[5]。因此，NMDA受体一方面参与神经元正常生理功能，另一方面在非正常生理状态下又可引起神经元病理死亡，具有正反两面双重角色[6,7]。

图1 脑缺血再灌注后神经元Src蛋白激酶表达分布(**P<0.01，*P<0.05)

图2 脑缺血再灌注后神经元NMDA受体亚基NR2A和NR2B的表达分布(**P<0.01，*P<0.05)

新近研究认为：NMDA受体群在突触间隙部位的激活，可引起与神经生理活动相关的正常信号，而NMDA受体群在突触周膜的激活则可介导细胞死亡的病理信号[8]。Src属于酪氨酸蛋白激酶，是感知受体激活并向胞内传递信号的核心蛋白激酶，参与神经元的多方面生理活动，如增殖、分裂、存活及突触可行性等[9]。由Src蛋白激酶介导的受体磷酸化可调节突触后膜NMDA受体群的动态平衡和突触间隙后膜上受体数量和组成成分，从而参与突触可塑性变化[10]。但Src蛋白激酶介导调节NMDA受体活性及受体群重塑在神经元延迟性死亡中发挥作用机制目前仍不清楚。

在本实验中，我们采取大鼠双侧颈总动脉夹闭合并股动脉抽血降血压法造成大鼠全脑缺血的动物模型，并采用差速离心法分离神经元突触的不同组分，结果发现缺血再灌注0.5 h及4 h后在突触后膜组分中Src蛋白激酶表达明显升高，处于超激活状态，而在NMDA受体调节亚基NR2A和NR2B的表达分布研究发现在突触外膜组分中缺血再灌注0.5 h、4 h、24 h后NMDA受体表达明显下降，在突触后膜组分中缺血再灌注0.5 h后NMDA受体表达明显升高，说明脑缺血再灌注后NMDA受体从突触周膜向突触后膜转移聚集，此外本实验发现突触后膜组分中缺血再灌注4 h和24 h后NMDA受体表达没有继续升高反而出现下降趋势，我们考虑在NMDA受体激活后NR2A和NR2B作为受体调节亚基与功能亚基NR1形成二或三异聚体，并成为谷氨酸的结合位点发挥功能，在此过程中NR2A和NR2B蛋白可能发生结构域的变化，因而Western Blot分析结果出现下降趋势。

总之，本实验结果提示：脑缺血再灌注后神经元突触后膜NMDA受体发生迁移重塑的机制，与神经元突触后膜Src蛋白激酶首先超激活状态并可介导NMDA受体重塑性，即NMDA受体从突触周膜向突触后膜迁移聚集有关。

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ThemechanismstudyonpostsynapticNMDAreceptorremoldabilityaftercerebralischemiareperfusion

ZHOUHai-xia,LIZhao-hui,ZHAOJing-wei.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of neuronspostsynaptic NMDA receptorremoldability after cerebral ischemia reperfusion.MethodsIn this study,Wistar rats with global cerebral ischemia-reperfusion model divided into is the normal group (Ctrl),ischemia-reperfusion 0.5 h group (I/R-0.5 h),ischemia-reperfusion 4 h group (I/R-4 h) and ischemia-reperfusion 24 h group (I/R-24 h).After arriving reperfusion,the brain tissue is removed and the homogenization buffer (HOM) was prepared.Synaptic membrane fraction (SYN) and Extrasynaptic membrane fraction (EXTRA) are separated by differential centrifugation.Expression distribution of Src protein kinase and expression distribution of NMDA receptor NR2A and NR2B are analyzed by Western Blot.ResultsWestern Blot analysis results indicate that the Src protein kinase appeared hyperactive in the SYN after ischemia-reperfusion 0.5 h (P<0.01),meanwhile the expression of NR2A and NR2B is decreased significantly in EXTRA (P<0.01) and increased in SYN (P<0.05).After ischemia-reperfusion 4 h,the Src protein kinase activation degree more obvious (P<0.01),and the expression of NR2A and NR2B in EXTRA are still decreased significantly (P<0.05),but NR2A and NR2B in SYN reduced at different degrees.ConclusionAfter cerebral ischemia reperfusion,Src protein kinase super activated state in post synaptic membrane of neurons mediating theremoldability of NMDA receptor NR2A and NR2B expression distribution，the NMDA receptor is gathered from Extrasynaptic membrane to Synaptic membrane.

Ischemia reperfusion;Src protein kinase;NMDA receptor;Mechanism

吉林省科学技术厅青年科研基金项目(20140520015JH)

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1423-04

R743

：A

2016-10-17)