通辽地区大肠埃希菌耐药性与Ⅰ类整合子关系研究

于 新,何成彦，魏学峰,郭钟贺,黄红兰*

(1.吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033；2.吉林大学基础医学院 病原生物学系，吉林 长春130021)

通辽地区大肠埃希菌耐药性与Ⅰ类整合子关系研究

于 新1,何成彦1，魏学峰2,郭钟贺2,黄红兰2*

(1.吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033；2.吉林大学基础医学院 病原生物学系，吉林 长春130021)

目的了解通辽地区大肠埃希菌临床分离株中I类整合子分布情况及基因盒类型，初步探讨耐药与整合子之间的关系。方法收集2013年10月-2014年3月通辽市某医院的非重复菌株作为试验菌株，采用Kirby-Bauer纸片法进行药敏试验；采用PCR方法扩增Ⅰ类整合酶基因，在此基础上扩增Ⅰ类整合子可变区，对部分基因盒阳性菌株测序并分析。结果99株大肠埃希菌临床分离株对所试23种抗生素中的13种耐药率高于50%，主要为对青霉素、磺胺类药物、头孢菌素等；Ⅰ类整合酶检出55株，检出率为55.56%；基因盒携带有36株，携带率为65.46%；共检出4种基因盒，共两种组合形式arr-3-dfrA27和dfrA17-AadA5。结论大肠埃希菌的耐药性与Ⅰ类整合子的存在有很大关系，dfrA17-AadA5是常见的基因盒组合形式。

大肠埃希菌；耐药性；整合子

(ChinJLabDiagn,2017,21:1316)

大肠埃希菌广泛存在于自然界中，可引起儿童的脑膜炎、败血症、泌尿道感染等多种感染性疾病[1-3]，严重威胁了人类的健康和日常生活。中国作为人均使用抗生素的大国，由于抗生素的大量、不规范使用，使得大肠埃希菌这类菌群的耐药机率，呈现逐年升高现象。整合子是一类可移动的基因元件，在耐药基因的水平传播中肩负着至关重要的任务[4]。本研究通过认识通辽相关区域临床大肠埃希菌株Ⅰ类整合子的分布情况及耐药基因盒的类型，来初步探究Ⅰ类整合子与这些菌株耐药性之间存在的关系和相互影响，从而为临床耐药研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2013年10月-2014年3月收集于通辽市某医院(已排除同一患者同一病患处重复菌株)，应用常规方法分离鉴定并保存，经梅里埃VITEK-2 COMPACT 全自动细菌鉴定/药敏分析系统鉴定。临床药物敏感性标准质控菌株ATCC25922采购自吉林省临床检验中心。

1.1.2 主要试剂与仪器 头孢唑啉(CFZ)、头孢噻肟(CTX)、头孢吡肟(FEP)、庆大霉素(GEN)、氨曲南(ATM)、氨苄西林(AMP)、左氧氟沙星(LEV)、头孢克洛(CEC)、复方新诺明(STX)、环丙沙星(CIP)、亚胺培南(IMP)、头孢哌酮/舒巴坦(CSF)、头孢西丁(FOX)、美罗培南(MEM)、头孢曲松(CRO)、哌拉西林(PIP)、阿莫西林/棒酸(AMC)、氨苄西林/舒巴坦(AMS)、头孢呋辛酯(CFX)、阿米卡星(AMK)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢他啶(CAZ)、四环素(TCY)(购自英国Oxoid公司)。使用仪器主要有PCR仪(美国赛默飞公司)，凝胶成像仪(上海天能公司)，VITEK-II全自动微生物鉴定药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离鉴定与药敏试验 采用 Kirby-Bauer纸片扩散法对分离鉴定的实验菌株行抗菌药物的敏感性检测，根据CLSI/NCCLS2005 年标准判断细菌的耐药情况。

1.2.2 大肠埃希菌总DNA提取 采取水煮法[5]提取菌株中的总DNA分子，分装后-20℃冰箱内保存备用。

1.2.3 测试Ⅰ类整合子-基因盒系统及耐药基因序列分析结果 按照参考文献[6,7]设计引物，用以扩增Ⅰ类整合酶与Ⅰ类整合子可变区，引物序列见表1。反应体系：2×Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30个循环；最后延伸72℃ 1 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳运行110v 30 min后EB(溴化乙锭)染色，在凝胶成像系统中观察目的条带。

表1 PCR引物序列

1.2.4 Ⅰ类整合子-基因盒中耐药基因分析 随机选取4株基因盒阳性菌株(j53、j49、j48、j57)的PCR产物，交由上海生工生物工程有限公司进行测序，得到的测序结果，在GenBank数据库中进行核酸序列同源性分析(BLASTn)。

2 结果

2.1 菌株药物敏感试验的检测结果

在所试抗菌药物中，99株大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素如美罗培南和亚胺培南等敏感度较高，其耐药率为5%和7%；对氨苄西林耐药率高达83%；而对头孢呋辛、庆大霉素、四环素、复方新诺明、氨苄西林/舒巴坦等的耐药率，则超过了50%。具体耐药结果见表2。

2.2 含Ⅰ类整合酶的菌株筛选结果

以483 bp处出现条带判定该菌株为含有Ⅰ类整合酶的阳性菌株，若无条带出现则判定为不含有Ⅰ类整合酶。99株菌中，共有55株(阳性率55.56%)在约500 bp处出现特异性条带，提示其所对应菌株可能携有Ⅰ类整合子。PCR产物部分电泳图见图1。

M：DL2000 Maker j47-j60：大肠杆菌

2.3携有Ⅰ类整合子-基因盒大肠埃希菌菌株的耐药分析

以前面获得的这55株菌株的DNA分子作为反应模板，以表1中的引物扩增Ⅰ类整合子的可变区，共出现36个Ⅰ类整合子阳性菌株(阳性率36.4%)，大小均在1 000 bp-2 000 bp之间，这些菌株中，其中19株菌株未检出基因盒。分析基因盒携带与否与大肠埃希菌耐药率之间的关系(见表3)，结果发现，比较23种抗菌药物的耐药情况，基因盒阴性的菌株耐药率普遍低于阳性菌株。经Fisher精确检验可见，两组大肠埃希菌对于氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、头孢呋辛、阿莫西林/棒酸、左氧氟沙星、氨曲南、阿米卡星的耐药性差异，具有统计学意义(P<0.05)。任意选取4株耐药相关基因盒阳性菌株的PCR产物测序，经BLASTn比对分析发现，四株菌中均含有不同种类的耐药基因盒，j53株含arr-3与dfrA27，j57、j49均携带dfrA17和AadA5。可见dfrA17-AadA5是所测菌中比较常见的耐药基因携带形式。

表2 99株大肠埃希菌耐药情况统计分析

表3 基因盒阳性菌株耐药分析

3 讨论

从全国细菌耐药监测网站提供的数据不难看出，在近年来大力控制抗生素用药的背景下，临床分离大肠埃希菌对喹诺酮类和碳青霉烯类以及三代头孢菌素等的耐药程度有所降低，但同比世界其他国家，我国仍处于较高的耐药水平，说明控制临床抗生素的耐药情况任重道远，需要全国范围的医务人员共同努力，严格把关。整合子作为天然的水平转移元件，不但可以跨过种属，更可以在细菌与真菌中介导耐药基因之间的传递[8]。在本研究中，99株大肠埃希菌的菌株，对所试23种抗生素其中13种抗生素的耐药率均超过50%，对亚胺培南和美罗培南两者较敏感，但耐药程度仍大于国内其它报道[9]。目前比较常见的与大肠埃希菌耐药紧密相连的整合子有3类，本文主要探究了Ⅰ类整合子-基因盒在这一过程中的作用。通过PCR技术筛选出55株大肠埃希菌含有Ⅰ类整合酶，阳性率为55.56%，与国内报道基本相近[10]，说明在抗生素大量使用这种社会环境下，细菌耐药性的形成在人群中具有普遍性。PCR扩增Ⅰ类整合酶阳性菌株的Ⅰ类整合子可变区时，36株菌株为阳性结果，基因盒阳性菌株的耐药率普遍高于阴性菌株，通过4株大肠杆菌整合子可变区测序结果分析显示，本实验中共出现arr-3、dfrA27、dfrA17和AadA5四种基因盒，有两种组合方式，其中dfrA17-AadA5的组合形式比较常见，有arr-3 利福平ADP-核糖基化转移酶，dfrA17编码二氢叶酸还原酶，介导磺胺类药物甲氧苄啶耐药，AadA5编码链霉素3’-腺苷酰基转移酶,介导对链霉素、庆大霉素等的耐药，可发现其中携带的基因盒类型与药敏试验结果不太符合，间接说明了整合子只是参与了细菌耐药机制的形成过程，而细菌对抗生素耐药的分子机制是受多种因素共同作用。

随着抗生素最后一道防线多粘菌素的突破，超级细菌的出现警示了合理用药的迫切需要。本文初步探讨了大肠埃希菌耐药与Ⅰ类整合子-基因盒之间密切关系，为更深入了解细菌产生耐药的分子机制和抗菌新药物的研究与发现提供更多可靠依据。

[1]Basmaci R,Bonacorsi S,Bidet P,et al.Escherichia Coli Meningitis Features in 325 Children From 2001 to 2013 in France[J].Journal of the American Veterinary Medical Association,2015,219(6):789.

[2]Wang S,Zhao SY,Xiao SZ,et al.Antimicrobial Resistance and Molecular Epidemiology of Escherichia coli Causing Bloodstream Infections in Three Hospitals in Shanghai,China[J].PLoS One,2016,11(1):e0147740.

[3]Reisner A,Maierl M,Jörger M,et al.Type 1 fimbriae contribute to catheter-associated urinary tract infections caused by Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,2014,196(5):931.

[4]Stokes HW,Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions:integrons[J].Molecular Microbiology,1990,3(12):1669.

[5]王广平，徐宗凯，仇秀琴，等.肠道菌群;DNA;提取方法[J].现代预防医学，2012(02)：405.

[6]Porres-Osante N,Azcona-Gutiérrez JM,Rojo-Bezares B,et al.Emergence of a multiresistant KPC-3 and VIM-1 carbapenemase-producing Escherichia coli strain in Spain[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2014,69(7):1792.

[7]Sáenz Y,Vinué L,Ruiz E,et al.Class 1 integrons lacking qacE Δ1 and sul1 genes in Escherichia coli isolates of food,animal and human origins[J].Veterinary Microbiology,2010,144(4):493.

[8]Rowe-Magnus DA,Mazel D.Integrons:natural tools for bacterial genome evolution[J].Current Opinion in Microbiology,2001,4(5):565.

[9]年 华,郭丽洁,丁丽萍,等.Mohnarin 2008 年度报告:东北地区细菌耐药监测[J].中国抗生素杂志,2010,35(7):482.

[10]李 彬,傅 蔷,黄心宏,等.整合子与多重耐药大肠埃希菌相关性研究[J].中国微生态学杂志,2010,22(2):135.

Correlationofantimicrobialresistancepatternswithclass1integronsinEscherichiacoliisolatesfromTongliaoarea

YUXin,HECheng-yan,WEIXue-feng,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo understand the distribution situation of class 1 integrons and Gene cassette type,inquire the relation between antimicrobial and resistance patterns.MethodsCollect non-repetitive strains in Tongliao Hospital from Oct.,2013 to Mar.2014 as trial bacterial strain,and use K-B method for drug sensitive tests,and use PCR method to amplify the class 1 integrons.And then use the result to amplify class 1 integron variable region and analyze the partial gene cassette positive strains.ResultsAntimicrobial susceptibility testing revealed that among the 99 clinical escherichia coli,there is more than 50% (>50%) of the isolates were resistant to 13 out of 23 antibiotics tested in this study,mainly is against penicillin,sulfonamide,cephalosporin and etc.PCR and DNA sequencing analysis revealed the presence of class I integrons is 55 isolates,i.e.relevance ratio 55.6%;gene cassettes of class I integrons is 36 isolates,i.e.carrier ratio 65.46%;there are 4 types of gene cassettes been tested,combined in 2 patterns,one was dfrA17 and aadA5,the other was aar-3 and dfrA27.ConclusionThe resistance of escherichia coli exhibited significant impact on the expression level of class I integrase,dfrA17 and aadA5 is a common form of gene cassettes combination.

Escherichia coli;Antibiotic Resistance;Integron

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1316-04

R378.2+1

：A

2016-03-22)