自拟宫颈方对宫颈炎模型大鼠宫颈组织VEGF-A、NF-KB表达的影响

朱迎萍 吴燕平

自拟宫颈方对宫颈炎模型大鼠宫颈组织VEGF-A、NF-KB表达的影响

朱迎萍 吴燕平

目的观察自拟宫颈方对宫颈炎模型大鼠宫颈组织病理及血管内皮生长因子A（VEGFA）、核转录因子（NF-KB）表达的影响。方法48只成年雌性大鼠，采用随机数字表法分为空白对照组12只和实验组36只，实验组大鼠给予阴道内注入25%苯酚胶浆（0.15mL/只）法建立大鼠宫颈炎动物模型。造模成功的36只大鼠再随机分为模型组、外用溃疡散组和自拟宫颈方组，每组12只。除空白对照组外，其余各组大鼠按0.1mL/0.1kg剂量，模型组大鼠给予蒸馏水胶浆，外用溃疡散组给予0.05g/mL外用溃疡散胶浆、自拟宫颈方组给予0.3g/mL自拟宫颈方胶浆，用灌胃针注入大鼠阴道深部，用自制医用无菌棉条堵塞阴道，隔天1次，共5次。观察各组大鼠宫颈形态及病理改变，蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测大鼠宫颈组织VEGF-A、NF-KB表达量。结果自拟宫颈方组、外用溃疡散组大鼠宫颈炎症程度较模型组明显减轻；自拟宫颈方组、外用溃疡散组大鼠宫颈组织VEGF-A、NF-KB表达水平显著低于模型组[VEGF-A：（0.703±0.150）、0.780±0.182）比（1.226± 0.160），P＜0.05；NF-KB：（0.088±0.015）、（0.068±0.008）比（0.183±0.041），P＜0.05]；自拟宫颈方组和外用溃疡散组大鼠宫颈组织VEGF-A、NF-KB表达量比较，差异无统计学意义[VEGF-A：（0.703± 0.150）比（0.780±0.182），P＞0.05；NF-KB：（0.088±0.015）比（0.068±0.008），P＞0.05]。结论自拟宫颈方能明显改善宫颈炎模型大鼠宫颈炎症程度，其作用可能与降低大鼠宫颈组织VEGF-A、NF-KB表达水平有关。

大鼠；宫颈炎；血管内皮生长因子A；核转录因子

宫颈炎以局部治疗为主，西医主要采用抗生素同时结合物理方法辅助治疗[1]，但有时因副作用导致患者顺应性差。中医药具有毒副作用小，标本兼治的作用[2]。自拟宫颈方是裘氏妇科创始人、首批国家名老中医裘笑梅主任中医师的经验方，治疗宫颈炎，有良好的临床疗效。本研究观察其治疗宫颈炎的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物48只健康未孕的雌性SD大鼠，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证：SCXK（沪）2008-0115。

1.2 实验药物苯酚：杭州双林化工试剂厂，批号20090528。甘油：商丘市亮峰卫生用品有限公司，批号131128。黄芪树胶：上海化学试剂采购供应站，批号811104。自拟宫颈方：明矾、儿茶各30g，冰片1g，碾粉，浙江省中医院制剂室提供。外用溃疡散：（组成：雄黄、寒水石、朱砂、银朱、石决明、冰片、人工麝香），内蒙古蒙药有限公司，国药准字Z15020458，批号1410025。核转录因子（NF-KB）试剂盒：联科生物技术股份有限公司。血管内皮生长因子A（VEGF-A）试剂盒：联科生物技术股份有限公司。25%的苯酚胶浆配制∶取液化苯酚5mL，黄芪树胶1g，甘油4mL，加蒸馏水至20mL，配成25%苯酚胶浆。

2 方法

2.1 造模及分组[3]大鼠适应性喂养1周后，成年雌性大鼠48只，采用随机数字表法分为空白对照组12只和实验组36只。实验组大鼠按0.15mL/只剂量，采用1mL注射器（针头为灌胃针头）向阴道内注入25%苯酚胶浆，然后使用自制医用无菌棉条堵塞阴道，防止药液流出，隔天1次，共5次。于末次给药24h后,四组大鼠各随机选取2只，麻醉后解剖取材阴道至子宫角处组织做病理切片，微镜下观察子宫颈组织油大量炎性细胞浸润提示造模成功。余30只造模成功大鼠随机分为模型组、外用溃疡散组和自拟宫颈方组，每组10只。

2.2 用药方法根据临床给药，以人体质量70kg为标准，按照人体表面积比率换算等效计量法（大鼠用量=成人日用量×0.018）计算大鼠给药剂量（70kg成人剂量：自拟宫颈方1次3g，外用溃疡散1次0.5g；大鼠给药剂量：外用溃疡散5mg/0.1kg，自拟宫颈方30mg/0.1kg）[3]。各组均用1mL注射器分别吸取蒸馏水胶浆、自拟宫颈方胶浆和外用溃疡散胶浆等（配制：蒸馏水胶浆：黄芪树胶0.5g，甘油3mL，加蒸馏水至10mL；自拟宫颈方胶浆：自拟宫颈方3g，黄芪树胶0.5g，甘油3mL，加蒸馏水至10mL；外用溃疡散胶浆：外用溃疡散0.5g，黄芪树胶0.5g，甘油3mL，加蒸馏水至10mL）。每组各10只大鼠，模型组给予蒸馏水胶浆，外用溃疡散组给予外用溃疡散胶浆（0.05g/ mL），自拟宫颈方组给予自拟宫颈方胶浆（0.3g/mL），各组均用1mL注射器取药，用灌胃针注入阴道深部并予自制医用无菌棉条堵塞阴道，隔天1次，0.1mL/ 0.1kg，共12次。

2.3 观察指标实验期间观察大鼠的一般情况（活动、饮食、精神状态），用药前后称大鼠体质量,每天观察并记录外阴局部及分泌物变化,大鼠阴道口是否干燥,外阴及阴道口黏膜有无充血、红肿，阴道有无流血。实验结束处死各组大鼠，取部分宫颈组织固定、脱水、包埋、切片、HE染色，光镜下观察病理变化并记录。部分宫颈组织收集等量浓度的蛋白，通过对蛋白进行电泳，转膜、封闭、孵育后应用Western Blot法检测VEGF-A、NF-KB蛋白表达量。

2.4 统计学方法应用SPSS18.0软件分析，计量资料采用均数±标准差（） 表示并作图，计量资料组内治疗前后比较用配对t检验，蛋白质免疫印迹多样本均数组间比较用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠体质量比较与实验前比较，实验结束后各组大鼠体质量明显增加（P＜0.05）。实验结束后，与模型组比较，自拟宫颈方组和外用溃疡散组大鼠体质量增加更明显（P＜0.05），见表1。

3.2 各组大鼠宫颈组织NF-KB、VEGF-A表达水平比较结果显示，与空白对照组比较，模型组宫颈组织NF-KB、VEGF-A表达明显升高（P均＜0.01）；与模型组比较，自拟宫颈方组和外用溃疡散组NF-KB、VEGF-A表达明显降低（P均＜0.05）；自拟宫颈方组与外用溃疡散组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、封三图1。

表1 各组大鼠体质量比较（g，）

表1 各组大鼠体质量比较（g，）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别空白对照组模型组自拟宫颈方组外用溃疡散组鼠数10 10 10 10实验前210.80±6.512 207.80±2.860 210.80±3.360 208.80±6.303实验结束276.60±10.234 242.00±2.309* 267.20±21.801*△264.60±15.414*△

表2 各组大鼠宫颈组织NF-KB、VEGF-A表达水平比较（g，）

表2 各组大鼠宫颈组织NF-KB、VEGF-A表达水平比较（g，）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05；NF-KB：核转录因子；VEGF-A：血管内皮生长因子

组别空白对照组模型组自拟宫颈方组外用溃疡散组鼠数5 5 5 5 NF-KB 0.056±0.036 0.183±0.041* 0.088±0.015△0.068±0.008△VEGF-A 0.584±0.520 1.226±0.160* 0.703±0.150△0.780±0.182△

3.3 各组大鼠宫颈形态学改变空白组大鼠阴道口光滑，无异物流出。阴道壁光洁、宫颈口光滑,无红肿。模型组大鼠阴道口红肿，部分大鼠有少量脓性分泌物。阴道壁水肿充血明显，宫颈口充血，重度炎症样改变。

3.4 各组大鼠宫颈组织病理变化空白组宫颈组织未见明显异常（见封三图2-A、1A）。模型组宫颈黏膜鳞状上皮细胞变性、坏死脱落，黏膜及其下固有层充血水肿和炎细胞浸润（淋巴细胞和中性粒细胞），内仍可见部分脓性渗出物及坏死组织（见封三图2-B、1B）。自拟宫颈方组：宫颈黏膜鳞状上皮增生修复，稍增厚，固有层增生，可见极少量炎性细胞，内未见炎性渗出物和坏死组织（见封三图2-C、1C）。外用溃疡散组宫颈部分坏死的宫颈黏膜处有肉芽组织机化，黏膜上皮化生，固有层有少量炎细胞浸润，内可见少量炎性渗出物和坏死组织（见封三图2-D、1D）。部分宫颈黏膜接近正常，未见明显异常改变。

4 讨论

宫颈炎（cervicitis）包括子宫颈阴道部炎症及子宫颈管黏膜炎症[4]。宫颈炎（cervicitis）的发病多为感染性，病理变化主要为炎症和渗出，血管新生也是炎症反应的重要特征[5-7]。宫颈炎主要表现为阴道分泌物增多，成年女性妇科的发病率约有90%，其中宫颈病占30%～45%[8]。宫颈炎若诊治不恰当，很容易上行感染，进而影响生育[9]。

研究认为，VEGF-A、NF-KB等与宫颈炎的发病有关[10]。NF-kB是一种能与免疫蛋白特异结合的一种多效性核转录因子，NF-kB属于Rel蛋白家族成员[11]，一般情况下，主要以异源二聚体或同源形式存在于细胞浆中，与NF-kB的抑制性蛋白（IkB）结合而呈非活性状态，当细胞受到病毒，物理创伤等刺激后，导致NF-kB活化，被激活后进入细胞核，入核后，转录功能明显增高，从而启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子基因表达，参与大部分基因的转录，介导缺氧，诱导VEGF-A表达而促使血管生成[12]。

VEGF是NF-kB的下游基因，属于受体酪氨酸激酶超家族，与血小板来源生长因子和成纤维生长因子同源。VEGF是迄今发现被认为是作用最强、特异性高的血管形成调控因子,主要分布于血管内皮细胞膜，是血管内皮细胞特异性的有丝分裂原[13]，分为多个单体，各单体与组织亲和力不同，其中VEGF-A不仅能通过调节纤溶酶原激活物及其抑制因子，从而促使内皮细胞增殖还能引起血浆蛋白从血管内渗漏到血管外区域，提高血管通透性的炎症表现[10]。VEGF-A及NF-kB与炎症的发生密切相关。近年来，生长因子用于宫颈糜烂的治疗已有大量的临床报道[13-14]，但中药促进宫颈糜烂的愈合的分子作用机制的研究尚少。

慢性宫颈炎属中医“带下病”范畴[15]，其病因主要归于脾虚失运，水湿不化；或肾虚失固，封藏失司；或摄生不慎，外感湿邪侵袭，湿邪郁结，水湿下注；或素体肾虚或者操劳过度伤肾。病机在于任带二脉受损、气血不畅[16]。治疗以清热解毒、活血化瘀为主[17]，同时须明确局部与全身的关系，区分脾虚、肾虚、肝郁、祛除湿热及湿瘀蕴结[15]，局部治疗采用阴道纳药，则宫颈炎症随之改善[18]。

外用溃疡散是由寒水石（凉制）、雄黄、朱砂、银朱、石决明（煅）、冰片、人工麝香组成的传统中药散剂。功效为去腐生肌，收敛，促进组织再生修复，加速糜烂面自然愈合。该药是不含任何辅料的极细粉末，与疮面组织有良好的亲和力，药物附着性好，又可避免使用其他药物的局部刺激，既能增加组织对缺氧的耐受性，增强机体免疫力[19]，局部用药，能对创面产生抗菌、止血、消肿、促进愈合等作用[20]。

“自拟宫颈方”包含明矾、儿茶、冰片三味中药，方中儿茶活血散瘀，收敛止血生肌，解毒收湿，药理研究显示，儿茶有抑菌，抗肿瘤，抗病原体，抗血小板，调血脂等作用[21]；冰片清热止痛，泻火解毒消肿，防腐生肌，有抗病原微生物，抗炎镇痛等功效，而且还可促进其他药物的吸收，提高药物的整体疗效[22]。明矾有解毒杀虫，燥湿止痒，可以降低前炎症因子水平，抗感染，改善机体免疫状态[23]。本研究结果表明，自拟宫颈方治疗宫颈炎大鼠疗效与外用溃疡散相当，显著降低模型大鼠宫颈组织NF-KB、VEGF-A表达，从而抑制炎症。

［1］中华医学会妇产科学分会.妇产科抗生素使用指南［J］.中华妇产科学杂志，2011，46（3）：231-232.

［2］邵茸，华海红，龙雁，等.慢性宫颈炎临床治疗分析［J］.内蒙古中医药，2013，32（11）：82-83.

［3］赵媛，周新娥.大鼠生殖道炎症动物模型的构建［J］.四川生理科学杂志，2007，29（1）：1-2.

［4］谢辛，苟文丽.妇产科学［M］.第8版.北京：人民卫生出版社，2013：255-257.

［5］Boris Ujevi，Jasna Habek.Prevalence of infection with neisseria gonorrhoeae or chlamydia trachomatis in acute mucopurulent cervicitis［J］.Arhiv Za Higijenu Radai Tokikologiju，2009，60（2）：197-203.

［6］薛辰，刘朝晖.宫颈炎诊断与治疗的进展［J］.中国妇产科临床杂志，2011，4（12）：316.

［7］Dalgic H，Kuscu NK.Laser therapy in chronic cervicitis［J］. Archives of Gynecology and Obstetrics，2001，265（2）：64-66.

［8］Marrazzo JM，Martin D.Management of women with cervicitis［J］.Clin Infect Dis，2007，44（2）：102-110.

［9］Matilda Berntsson.Clinical and microscopic signs of cervicitis and urethritis：correlation with chlamydia trachomatis infection in female STI patients［J］.Acta Dermato-Venereologica，2013，93（2）：230-233.

［10］李世蓉，张三元.NF-kB和VEGF在不同宫颈病变组织中的表达及其意义［J］.中国妇幼保健，2011，26（34）：220-221.

［11］于敬杰，温子玉，杨建立，等.NF-κB与学习记忆关系的研究进展［J］.医学信息，2015，28（34）：377.

［12］孙加升，潘运龙，覃莉，等.核转录因子KBp65、血管内皮生长因子A和p53在直肠癌中的表达及其临床意义［J］.实用医学杂志，2009，25（10）：1579-1580.

［13］宫桂花，王从容，杨雪，等.宫颈疾病的诊疗进展［J］.军医进修学院报，2014，18（11）：37-39.

［14］李贵玲，李亦武.微波灼伤创面应用生长因子后的DNA含量分析［J］.中国药师，2006，9（10）：889-891.

［15］王春红.中西医结合治疗慢性宫颈炎的临床疗效观察［J］.中国保健营养，2015，11（下）：357.

［16］井玥，赵余庆，倪春雷.儿茶的化学、药理与临床研究［J］.中草药，2005，36（5）：790-791.

［17］邓霭静.中医诊治带下病学术源流探讨及文献整理研究［D］.广州中医药大学，2014：5.

［18］毛利云，高丽平.中药外用治疗慢性宫颈炎的实验研究进展［J］.湖南中医杂志，2006，22（1）：76-77.

［19］马铁玉，陈红楠.宫颈上皮内瘤变环形电切术后创面恢复采用外用溃疡散的临床效果观察［J］.河北医学，2015，21（8）：1499-1500.

［20］张吉，林忠，刘英.外用溃疡散促宫颈上皮内瘤变环形电切术后创面恢复的效果观察［J］.现代中西医结合杂志，2012，（11）：1169-1170.

［21］尹志萍，张古英，王建军.儿茶及儿茶素的研究进展［J］.河北医药，2008，30（3）：360.

［22］魏楚蓉.冰片的药理作用及其机制研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2010，30（4）：447-448.

［23］尤淑霞，吴德康，刘圣金，等.白矾的基原考证及药理作用［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（7）：111-112.

（收稿：2016-07-29 修回：2017-02-22）

Effect of Self-prescription on the Expression of VEGF-A and NF-κB in Rats with Cervicitis

ZHU Yingping,WU YanpingDepartment of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310018),China

ObjectiveTo investigate the efficacy of self-prescription on the pathological changes of cervical tissues and the expression of vascular endothelial growth factor-A（VEGF-A）and nuclear factor kappaB（NF-κB）in rats with vervicitis.MethodsForty-eight adult female rats were distributed at random to blank control group(12 rats)and experimental group（36 rats）.The rats in the experimental group were injected with 25%phenol slurry（0.15mL per rat）to the vagina to establish the cervicitis model,then randomly divided into model group,Waiyongkuiyangsan group,and self-prescription group,with 12 rats in each group.Except for blank control group,model group was given still water,Waiyongkuiyangsan group was given a thick liquid of Waiyongkuiyangsan（0.05g/mL）, and self-prescription group was given a thick liquid of self-prescribed herbs（0.3g/mL）,all at the dosage of 0.1mL/ 0.1kg.The corresponding drugs were administered via injection into the vagina and the vaginal orifice was blocked with self-made tampons,one treatment every 2 days,for 5 times.After the treatment,the morphology and pathology of the cervix was observed;Western blot analysis was performed to detect the levels of VEGF-A and NF-κB in cervical tissues.ResultsCompared with model group,the inflammation of cervix in self-prescription group and Waiyongkuiyangsan group was reduced and the levels of VEGF-A and NF-κB in cervical tissues were decreased（VEGF-A∶0.703±0.150 and 0.780±0.182 vs 1.226±0.160,P＜0.05;NF-κB∶0.088±0.015 and 0.068±0.088 vs0.183±0.041,P＜0.05）,but no significant difference in VEGF-A and NF-κB was found between self-prescription group and Waiyongkuiyangsan group（VEGF-A∶0.703±0.150 vs 0.780±0.182,P＞0.05;NF-KB∶0.088±0.015 vs 0.068±0.008,P＞0.05）.ConclusionSelf-made prescription for the treatment of cervicitis can attenuate the inflammation of cervix in rats with cervicitis via down-regulating the expression of NF-κB and VEGF in cervical tissues.

rats;cervicitis;nuclear factor kappaB;vascular endothelial growth factor-A

book=752,ebook=21

浙江中医药大学附属第一医院妇产科（杭州310018）

朱迎萍，Tel：18268155196；E-mail：zhuyingping_26@126.com