桃叶珊瑚苷对UVA致ESF—1细胞光老化保护作用的代谢组学研究

李雪　雷雪雪　徐红丹

[摘要] 目的 采用高通量细胞代谢组学技术分析桃叶珊瑚苷干预光老化ESF-1细胞的效应机制和有效作用靶点。 方法 细胞UVA损伤模型法制备光老化细胞模型，给予低中高不同剂量的桃叶珊瑚苷DMEM培养液进行干预，通过检测细胞所含总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活性和含量评价光老化ESF-1细胞模型的氧化损伤情况及桃叶珊瑚苷对模型的干預作用。在此基础上基于高分辨质谱技术对正常细胞、光老化细胞及桃叶珊瑚苷干预后的细胞进行高通量的代谢足迹分析。通过模式识别技术对海量的数据采取降维处理和多元统计分析。 结果 与空白组相比，模型组细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性明显降低，MDA含量明显升高（P < 0.01）；与模型组相比，给药组能提高SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量，其中中、高剂量组差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。光老化细胞代谢与空白组细胞存在显著性差异，发生扰乱的代谢主要集中在花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢。通过聚焦分析发现了6个核心的生物标志物，且这些小分子代谢产物在给予桃叶珊瑚苷干预后都发生了有效的回调。 结论 桃叶珊瑚苷对光老化有很好的治疗作用，其作用机制可能与花生四烯酸代谢机制相关，本研究为早期预防和药物研发提供了新思路和新方法。

[关键词] 代谢组学；模式识别；桃叶珊瑚苷；光老化；生物标志物

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0025-05

[Abstract] Objective To analyze the mechanism and effective target of aucubin intervene photoaging ESF-1 cells by high through-put cell metabolomics. Methods Cell photoaging model was established by UVA cell injury method， then given low medium and high dose aucubin DMEM medium for the intervention. The activities and contents of total superoxide dismutase （T-SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， catalase （CAT）， malondialdehyde （MDA） were detected for the evaluation of oxidative damage and aucubin treatment effect. Based on above analysis and high resolution mass spectrometry， the high throughput metabolic footprint analysis was conducted in the normal cells， photoaging ESF-1 cells and aucubin intervention cell. Massive metabolic data were analzyed with dimension reduction process and multivariate statistics by model discriminating technique. Results Compared with the blank group， the activities of SOD， GSH-Px， CAT significantly decreased and contents of MDA significantly increased in the model group （P < 0.01）. Compared with the model group， the activities of SOD， GSH-Px， CAT increased and contents of MDA decreased in the medication gorups， of which， in the medium and high doses medication groups the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. There were significant differences in the metabolism between the normal cells and the photoaging ESF-1 cells， and the disturbance of metabolism was mainly concentrated in arachidonic acid metabolism， glutathione metabolism. 6 core biomarkers were identified by focusing analysis， and these small molecular metabolites were callback after the administration of aucubin. Conclusion Aucubin has a favorable effect on photoaging， and the mechanism may be related to arachidonic acid metabolism. Besides， the present investigation provides new ideas and methods for early prevention and drug development.endprint

[Key words] Metabolomics； Pattern recognition； Aucubin； Photoaging； Biomarker

随着环境的日益恶化及大气层的破坏，辐射地球的紫外光（UV）照射强度越来越大，这致使其对皮肤组织的氧化损伤日益严重，并导致光老化等一系列皮肤问题[1-6]。目前，UV辐射对健康的危害已成为全球关注的重大环境与健康问题之一，从天然产物中提取有效成分对其进行干预也是防止光老化的热点研究之一[7-17]。杜仲药材为金缕梅亚纲、杜仲目、杜仲科、杜仲属植物的干燥茎皮，在我国有2000余年的药用历史，《神农本草经》列为上品。相关研究表明，杜仲对由紫外照射的皮肤光老化有很好的保护作用。桃叶珊瑚苷作为杜仲有效成分，具有保肝、抗癌、解毒、抗氧化等功效。本研究基于高通量的代谢组学技术靶向性分析杜仲所含有效成分桃叶珊瑚苷对光老化ESF-1细胞干预作用，为阐明光老化代谢机制和桃叶珊瑚苷作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX Triple QuadTM3500（美国AB SCIEX公司），XPE105分析天平（瑞士梅特勒托利多），RT-9000半自动生化分析仪（美国雷杜公司），人皮肤成纤维细胞ESF-1（北京协和医学院细胞资源中心），DMEM培养基，超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程公司），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程公司），过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程公司），丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程公司），桃叶珊瑚苷标准品（上海锐谷生物科技有限公司）。

1.2 给药溶液配制

将桃叶珊瑚苷加入DMEM培养液中，配制成高（4×10-5 mol/L）、中（4×10-6 mol/L）、低（4×10-7 mol/L）3个浓度，调pH值为7.0，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。

1.3 ESF-1细胞体外培养

ESF-1细胞培养于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的10%胎牛血清DMEM。取对数生长期细胞以胰酶消化，调整其密度为1×106个/mL接种于6孔板、5×104个/mL接种于96孔板。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞UVA损伤模型的建立 参考文献[18]方法，空白组给予遮蔽处理。

1.4.2 实验分组 细胞随机分为空白组、模型组、给药组。空白组细胞给予DMEM培养液培养；模型组和给药组细胞给予DMEM培养液培养24 h后，按照“1.4.1”项下方法进行模型制备，且给药组给予含不同浓度（4×10-5、4×10-6、4×10-7 mol/L）桃叶珊瑚苷的DMEM培养液继续培养。

1.4.3 氧化损伤指标检测 给药24 h后收集6孔板中各组细胞，用冷PBS清洗2次，超声破碎，严格按试剂盒说明流程检测细胞所含总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活性及含量。

1.4.4 细胞提取 取对数期生长细胞，弃培养基，以生理盐水清洗细胞3遍，液氮淬灭后加入1.5 mL的甲醇-水（4∶1，v/v）溶液，细胞刮刀取下细胞，并置入1.5 mL离心管中涡旋，超声破碎细胞。细胞破碎后4℃ 4000 r/min离心15 min。取上清液氮气吹干，100 μL 0.1%甲酸复溶。

1.4.5 分析条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（Waters集团公司，美国）；流动相分别为0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液；柱温40℃；流速0.4 mL/min；进样量为2 μL；色谱梯度为0～10 min，50%B～60%B、10～13 min，60%～65%B、13～15 min，65%～99%B。质谱采用电喷雾离子源（ESI），ESI+模式毛细管电压设定为3.0 kV，锥孔电压为30 V；ESI-模式毛细管电压设定为3.0 kV，锥孔电压为30 V。

1.4.6 数据处理及生物标志物鉴定 原始数据通过代谢组学最新权威数据分析系统XCMS进行数据预处理，对色谱及质谱数据进行峰对齐、归一化等基础性处理后，导入SIMCA-13用于模式识别运算，结合VIP值筛选对分组贡献率大的内源性小分子代谢产物。最终通过Metline、HMDB、KEGG等数据库进行检索和比对以鉴定生物标志物。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±標准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桃叶珊瑚苷对ESF-1细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影响

UVA照射及不同剂量桃叶珊瑚苷对ESF-1细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影响见表1。与空白组相比，模型组细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性明显降低，MDA含量明显升高（P < 0.01）；与模型组相比，给药组能提高SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量，其中中、高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 代谢组学研究

主成分分析得分图显示，空白组、模型组和高、中、低给药组的组内聚类良好，组间分离明显（图1）。空白组和模型组组间分离明显，证明两组细胞内的代谢产物具有极大差异，可能由光老化因素诱导产生。发生扰乱的代谢主要集中在花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢。不同剂量给药组处于空白组和模型组之间，证明药物的干预对光老化细胞有很好的回调作用。endprint

采用正交偏最小二乘判別分析筛选空白组和模型组组间对分组具有显著性贡献的小分子代谢产物作为潜在生物标志物（图2～3）。选取重要变量投影值>3，进一步通过相关数据库检索进行比对，鉴定了6个光老化潜在生物标志物，根据细胞代谢所涉及的生物学信息构建光老化ESF-1细胞的代谢网络（图4）。

3 讨论

随着环境污染问题的日益严重，紫外光辐射等问题日益加剧，这其中光老化是严重影响生活质量的重要因素之一。单纯从皮肤表面增白角度入手难以达到根治，中药因多成分多靶点协同起效、副作用小等优势在治疗慢性病或调解亚健康状态方面有很好的效果。近年来应用杜仲干预由紫外线诱导的皮肤光老化效果明显，且国内外研究表明花生四烯酸代谢与光老化密切相关[19-21]。目前已知白三烯（LTB4）是参与光老化过程中的重要炎症介质[22]，其经5-LOX代谢后产生花生四烯酸，即为花生四烯酸产生的限速酶。皮肤角质层细胞由于缺乏5-LOX，不能单独产生LTB4。本实验发现，紫外线可能作为诱导5-LOX增加的因素，使LTB4升高，导致花生四烯酸含量代谢异常。

谷胱甘肽代谢为本次发现的重要通路之一，结合GSH-Px试剂盒活性测定结果发现，光老化细胞内的还原性谷胱甘肽酶活性不高，这可能与紫外光辐射后胞内产生氧化损伤有关[23-30]。大量的还原态代谢酶用于修复氧化性损伤，故活性降低，细胞代谢组学研究与试剂盒结果相一致，推断上述代谢机制发生与光老化密切相关。

代谢组学作为系统生物学的重要分支，因其具有的整体性、动态性与中医药理论相一致，近年来在解读中医药症候理论和方剂配伍作用方面有较为广泛的应用。本研究首次依托细胞代谢组学技术针对性研究紫外线诱导的光老化ESF-1细胞的发病机制，以期为光老化药物作用靶点研究和相关产品的基础研究奠定实验基础。

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（收稿日期：2017-05-02 本文編辑：程 铭）endprint