牛骨胶原蛋白酶解工艺优化及结构特性分析

刘丽莉

李 丹

杨陈柳

孟圆圆

代晓凝

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

牛骨胶原蛋白酶解工艺优化及结构特性分析

刘丽莉

李 丹

杨陈柳

孟圆圆

代晓凝

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

牛骨；胶原蛋白；酶解；结构特性

近年来，随着人们对肉制品需求的增加，其副产物——动物骨骼的加工利用受到研究学者的广泛关注。动物骨骼中含有如蛋白质、氨基酸、矿物质、软骨素、骨胶等具有保健作用的功能物质[1]，其所含的蛋白质中，胶原蛋白占到90%以上，能够促进人体皮下组织的代谢功能，还可以延缓衰老[2]。但胶原蛋白具有特殊的三股螺旋结构，难以被人体消化吸收。而胶原蛋白肽是胶原的三股螺旋结构中分子链被断开形成的小分子蛋白，是一类具有较强的水溶性、蛋白含量高且黏度较低、极易被人体吸收的产物，具有抗氧化、降血压、降血脂的功能特性[3-5]。

目前多数研究学者将微生物与骨胶原相结合进行发酵降解，如张宇等[6]的研究表明采用红曲菌与米曲菌复合发酵猪骨能够较好地降解骨胶原；彭慧莉[7]采用乳酸菌发酵猪骨泥，有效提升了其利用价值。有学者研究发现，与微生物发酵法相比，酶解法降解骨骼时间短，效率高，更适合应用到实际生产，如蔡丽华等[8]将碱性蛋白酶作用到牛骨来制备降压肽；赵妍嫣等[9]采用胰蛋白酶作用于骨胶原，结果表明与胶原蛋白相比，酶解后的蛋白肽有更好的乳化性和溶解性；Zhang Yuhao等[10]将牛骨胶原通过6种常规蛋白酶处理与未处理的进行对比发现，处理后的产物胶原蛋白肽可以降低血压。但这些研究所采用的蛋白酶对骨骼的降解程度仍未达到较佳的工业利用价值。本课题组前期曾纯化出了具有特异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶(Bone-specific collagenase，BSC)，较其他蛋白酶其对牛骨胶原蛋白有更好的降解效果。本研究拟对胶原蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白的工艺进行优化，并进行结构特性分析，为今后的工业化生产提供理论依据。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

新鲜牛骨头：购买于河南省洛阳市大张购物中心；

溴化钾、乙醇、3-甲氧基-4’-N，N-二甲氨基黄酮、甲醛：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机：H1650型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

pH计：PHS-3C型，上海精科有限公司；

荧光分光光度计：RF-5301PC型，日本岛津有限公司；

紫外可见分光光度计：UV2600型，日本岛津有限公司；

FT-IR红外光谱仪：Perten DA7200型，德国Bruker公司；

扫描电镜：JSM-IT500型，日本Jeol有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨胶原蛋白的制备 将新鲜采购的牛骨骼除去表面牛肉纤维，在高温高压下蒸煮20 min后将其分成颗粒，采用乙醚回流脱脂(40 ℃)，0.48%盐酸脱钙，骨粒径为5 mm×10 mm，提取胶原的介质为1%柠檬酸和1%胃蛋白酶复合液。经真空冷冻干燥获得牛骨I型胶原蛋白[11]。

1.3.2 BSC酶的制备流程

(1) 菌种发酵培养基：蔗糖1 g/100 mL，胰蛋白胨2 g/100 mL，氯化钙 0.05 g/100 mL，磷酸二氢钠 0.05 g/100 mL，磷酸氢二钾 0.25 g/100 mL，pH值6.6～6.8。

(2) 将活化好的B.cereusMBL13-U菌株在35 ℃，160 r/min 的条件下连续发酵46 h，收集发酵液12 000 r/min，4 ℃ 离心25 min，收集上清液即为BSC酶的粗酶液，将其依次通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析，最终得到分子量为52 kDa 的BSC酶。

1.3.3 BSC酶解牛骨胶原蛋白的酶解工艺 向牛骨胶原蛋白中加入适量的BSC酶，调节pH值，置于恒温培养摇床中进行酶解反应，反应结束后90 ℃灭酶15 min，12 000 r/min离心15 min，将上清液干燥后得到胶原蛋白肽。

酶解液中水解度的测定：采用甲醛滴定法[12]。

1.3.4 BSC酶解牛骨胶原蛋白的工艺优化

(1) 单因素试验：主要选取影响酶解反应的5个因素[13]，反应温度(35，40，45，50，55，65 ℃)、牛骨胶原蛋白添加量(1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 g/100 mL)、BSC酶添加量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g/100 mL)、反应时间(1，2，3，4，5，6，7，8，9 h)、pH值(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)。固定酶解参数为：反应温度 35 ℃、牛骨胶原蛋白添加量 3.5 g/100 mL、BSC酶添加量 0.4 g/100 mL、反应时间 5 h、pH值 7.0，分别改变其中一因素，进行单因素试验，研究其对水解度的影响，得出最佳反应参数。

(2) 响应曲面优化试验：在单因素试验基础上，采用五元二次正交旋转试验组合设计，以反应温度、牛骨胶原蛋白添加量、BSC酶添加量、反应时间、pH值为考察因素，以水解度为响应值(Y)，得出酶解最适工艺参数组合。

1.3.5 牛骨胶原蛋白及胶原蛋白肽的结构特性

(1) 紫外光谱分析：将酶解0，2，4，6 h的胶原蛋白肽液在紫外-可见光分光光度计上进行全波长扫描，波长范围为215 ～250 nm。

(2) 荧光光谱分析：将3-甲氧基-4′-N，N-二甲氨基黄酮溶于乙醇中作为荧光探针，分别加入酶解0，2，4，6 h的胶原蛋白肽液中，设置激发波长380 nm，发射波长465 nm[14]，分别将其放入荧光分光光度计中进行扫描。

(3) 红外光谱分析：分别将牛骨胶原蛋白和胶原蛋白肽与适量的溴化钾充分混合后压片制样，将其放入FT-IR红外光谱仪中在400～4 000 cm-1波长下进行扫描[15]。

(4) 扫描电镜分析：分别将酶解0，2，4，6 h后的牛骨胶原蛋白真空冷冻干燥后进行喷金处理，再将样品放入扫描电镜下观察表面结构的变化。

1.3.6 数据处理 采用Origin 8.5、Design Expert 8.0软件对本试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

不同酶解条件对水解度的影响见图1。

由图1(a)可知，水解度随反应温度的增加先升高后急速下降，在45 ℃时最大。这是因为随着温度的上升，胶原蛋白的三股螺旋结构逐渐展开，BSC酶的催化活性增强，但过高的温度会逐渐破坏BSC酶的分子结构，活性降低，直到失活，同时也会改变产物的形成方向，导致水解度直线下降。因此，选取最佳反应温度为45 ℃。

由图1(b)可知，随着牛骨胶原蛋白添加量的逐渐增加，溶质流动性较好，使牛骨胶原蛋白与BSC酶充分结合，水解度逐渐上升，当牛骨胶原蛋白添加量达到4.5 g/100 mL时水解度最高，但随其添加量的继续增加，溶液黏度增大，阻碍了反应进行，水解度降低。因此，选取最佳牛骨胶原蛋白添加量为4.5 g/100 mL。

由图1(c)可知，水解度的变化随着BSC酶添加量的增加先升高后缓慢降低，当BSC酶添加量为0.3 g/100 mL时水解度最大，认为在牛骨胶原蛋白含量一定时，BSC酶添加量的增加会加大两者结合程度，使水解度不断上升，但过多BSC酶的加入使牛骨胶原蛋白相对不足，导致反应进程减弱，水解度下降[16]。因此，选取最佳BSC酶添加量为0.3 g/100 mL。

由图1(d)可知，随反应时间的增加，BSC酶与牛骨胶原蛋白的结合作用不断加大，在6 h时两者充分作用，水解度最大，若反应时间继续延长，牛骨胶原蛋白浓度逐渐降低，BSC酶催化位点不断减少，水解度下降[17]。因此，选取最佳反应时间为6 h。

由图1(e)可知，随pH值的升高，水解度也逐渐加大，在pH 7.0时达到最大，但pH值进一步升高水解度快速降低，原因是pH值对BSC酶活性的相关基团影响较大，环境过酸或过碱都会破坏其分子构象，活性降低，同时还会影响牛骨胶原蛋白与BSC酶在反应中的解离状态，抑制反应的进行。因此，选取最佳pH值为7.0。

2.2 响应曲面优化试验结果分析

在2.1得到最佳单因素条件(见表1)基础上，采用五元二次正交旋转组合试验设计对酶解工艺进行优化，设计方案及结果和方差分析见表2、3。

图1 酶解条件对水解度的影响

水平X1反应温度/℃X2牛骨胶原蛋白添加量/(10-2g·mL-1)X3BSC酶添加量/(10-2g·mL-1)X4反应时间/hX5pH值-2351.50.22.05.0-1403.00.33.56.00454.50.45.07.01506.00.56.58.02557.50.68.09.0

表2五元二次正交旋转组合试验设计方案及结果

Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimen-tal design (in coded level of five variables)and experimental result (n=3)

试验号X1X2X3X4X5Y水解度/%11111125.592111-1-124.93311-11-129.23411-1-1118.3651-111-124.0261-11-1116.7171-1-11122.6181-1-1-1-120.369-1111-128.6110-111-1129.2311-11-11122.6212-11-1-1-120.2813-1-111123.7614-1-11-1-117.9115-1-1-11-121.2816-1-1-1-1117.2517-2000021.68182000024.49190-200018.75200200024.052100-20017.67220020023.5623000-2023.03240002026.99250000-225.56260000223.28270000032.65280000032.51290000030.08300000033.57310000028.33320000028.86330000029.74340000033.68350000032.19360000031.15

采用Design Expert 8.0对优化结果进行多元回归拟合，得出回归方程为：

(1)

表3 方差分析表

表3结果表明，拟合的二次回归方程极显著，失拟项P值不显著(P=0.367 1>0.05)，决定系数R2为93.07%，模型拟合度较高，证明所建立的模型有效可用。由F值高低得五因素对水解度的影响依次为：牛骨胶原蛋白添加量、反应时间、BSC酶添加量、pH值、反应温度。

本试验构建的模型在α=0.05显著水平下剔除不显著水平后的方程为：

(2)

2.3 构建模型的等高线与响应面分析

由图2可知，在最佳值的范围外响应面比较陡峭，表明当其他3因素为定值时，水解度对BSC酶添加量和反应温度的变化敏感，两者等高线图为椭圆状，表明BSC酶添加量和反应温度有较为明显的交互作用[18]。从等高线图分析表明，当固定牛骨胶原蛋白添加量5.14 g/100 mL、反应时间6.06 h、pH 6.57时，BSC酶添加量在0.35～0.50 g/100 mL，反应温度在40.6～49.2 ℃时，两者交互作用最明显，水解度达到30%。

图3中反应温度和pH值的响应面图显示，在最佳值的范围外响应面陡峭，表明当其他3因素不变时，pH值和反应温度的变化对水解度影响较大，等高线图呈明显椭圆状反映出两者有较为明显的交互作用。等高线图分析表明，当牛骨胶原蛋白添加量5.14 g/100 mL、反应时间6.06 h、BSC酶添加量0.42 g/100 mL时，反应温度在44.0～47.6 ℃，pH在6.3～7.1时交互作用达到最大，水解度在31%以上。

图3 反应温度和pH值对水解度影响的响应面和等高线图

2.4 BSC酶解牛骨胶原蛋白的工艺优化及验证

经五元二次正交旋转试验及响应面优化法，采用Design Expert 8.0软件和回归方程分析可得BSC酶解牛骨胶原蛋白的最佳工艺为：反应温度46 ℃、牛骨胶原蛋白添加量5.14 g/100 mL、BSC酶添加量0.42 g/100 mL、反应时间6 h、pH值为6.5，对此条件进行验证实验，重复6次，得到水解度为34.98%，与预测值相差1.15%，误差较小，此条件下试验可行。

2.5 紫外光谱分析

图4为不同酶解时间下胶原蛋白肽的紫外光谱扫描图。

由图4可知，I、II、Ⅲ、Ⅳ均在220～230 nm内出现胶原蛋白及胶原蛋白肽的特征吸收，并且特征吸收峰随着酶解时间的延长发生红移，说明胶原蛋白肽中生色基团的分布有所改变，牛骨胶原蛋白在BSC酶作用下三股螺旋结构逐渐打开，分子表面C═O、CONH2、COOH等具有紫外吸收的生色基团逐步增多[19]，导致紫外吸光度逐渐增大。

Ⅰ～Ⅳ酶解时间分别为0，2，4，6 h

2.6 荧光光谱分析

图5为不同酶解时间下胶原蛋白肽的荧光光谱扫描图。

Ⅰ～Ⅳ酶解时间分别为0，2，4，6 h

2.7 红外光谱分析

图6为牛骨胶原蛋白和降解物胶原蛋白肽的红外光谱图。

图6 牛骨胶原蛋白和胶原蛋白肽的红外光谱分析

由图6可知，牛骨胶原蛋白和胶原蛋白肽分别在3 312.35，3 267.96 cm-1处呈现明显的吸收峰，这是由N—H伸缩振动引起的，是蛋白的特征吸收，经BSC酶降解作用，牛骨胶原蛋白的吸收峰发生红移，是酶解后的胶原蛋白肽中N—H伸缩振动与氢键形成了缔合体[20]所导致的。胶原蛋白肽在2 922.63 cm-1出现强吸收峰，是—CONH—的特征吸收峰，表明酶解产物为胶原多肽。1 360～1 200 cm-1为酰胺Ⅲ带，二者在此波数范围内均出现特征吸收，为C—H伸缩振动和N—H弯曲振动所产生的，但是胶原蛋白肽具有较强的吸收峰，表明在BSC酶作用下牛骨胶原蛋白的肽链发生断裂，酶解后的胶原蛋白肽二级结构居多，由图6(b)可知，经过酶解的胶原蛋白肽在1 275.75 cm-1处出现强吸收峰，是β-转角伸缩振动引起的，表明胶原蛋白肽结构中以β-转角为主，可能是酶解过程中有较多的游离脯氨酸，其分子中的环状结构和平面角对β-转角的形成具有催化作用。

2.8 扫描电镜分析

图7为不同酶解时间下牛骨胶原蛋白的扫描电镜图。

图7 不同酶解时间下牛骨胶原蛋白的扫描电镜图

由图7可知，BSC酶对牛骨胶原蛋白的表面结构影响较大，其中图7(a)中牛骨胶原蛋白的表面结构为细丝状，但图7(b)、(c)、(d)显示牛骨胶原蛋白的表面结构随着酶解时间的延长而逐渐被剥离，这是由于BSC酶将牛骨胶原蛋白中的I型胶原蛋白降解为小分子多肽，破坏了其完整的表面结构，使牛骨胶原蛋白中所含的大分子物质I型胶原蛋白越来越多地暴露在表面，加快了BSC酶的作用，水解越来越显著，导致紧密结合的细丝状表面结构变得更加疏松。

3 结论

(1) 本试验将前期分离纯化得到的BSC酶作用于牛骨胶原蛋白，以水解度为指标，在单因素试验基础上，采用五元二次正交旋转试验和响应面优化法得出酶解的最佳工艺参数为反应温度46 ℃、牛骨胶原蛋白添加量5.14 g/100 mL、BSC酶添加量0.42 g/100 mL、反应时间6 h、pH 6.5，在此条件下进行验证实验，得到水解度为34.98%。

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Optimization of Enzymatic hydrolysis process and analysis of structural properties on bovine bone crude collagen

LIULi-li

LIDan

YANGChen-liu

MENGYuan-yuan

DAIXiao-ning

(CollegeofFoodandBioengineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471023,China)

novel collagenase; bovine bone collagen; enzymatic hydrolysis; optimization; structural properties

国家自然科学基金(编号：31401622)；公益性行业(农业)科研专项(编号：201303084)；河南省重点攻关项目(编号：152102110080)；河南省教育厅自然科学研究项目(编号：13A550255)；河南省重大专项(编号：161100110900)

刘丽莉(1974—)，女，河南科技大学副教授，博士。 E-mail：yangliuyilang@126.com

2017—04—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.009