白酒中环二肽成分的分析研究

邓霞玲，练顺才，谢正敏，廖勤俭，叶华夏，张 倩

(四川宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644007)

白酒中环二肽成分的分析研究

邓霞玲，练顺才，谢正敏，廖勤俭，叶华夏，张 倩

(四川宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644007)

采用HPLC-QTOF高分辨质谱仪在白酒样品中检测到13种环二肽化合物，并定性鉴定为环（丙氨酸-脯氨酸）、环（二氨基丁酸）、环（亮氨酸-丙氨酸）、环（异亮氨酸-缬氨酸）、环（苏氨酸-脯氨酸）、环（脯氨酸-苯丙氨酸）、环（苯丙氨酸-丙氨酸）、环（亮氨酸-异亮氨酸）、环（缬氨酸-缬氨酸）、环（酪氨酸-脯氨酸）、环（苯丙氨酸-缬氨酸）、环（脯氨酸-亮氨酸）、环（二苯丙氨酸）等。其中环（亮氨酸-丙氨酸）、环（脯氨酸-苯丙氨酸）、环（苯丙氨酸-丙氨酸）、环（酪氨酸-脯氨酸）、环（脯氨酸-亮氨酸）具有多种生理活性。

白酒； 环二肽； HPLC-QTOF

环二肽（cyclic dipeptides）又叫2，5-二酮哌嗪等衍生物(2,5-diketopiperazine derivatives)，该类化合物在人、脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌中均有发现，由于环二肽形成一个稳定的六元环结构，具有一定的构象约束作用，有两个氢键给体和两个氢键受体，氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因而环二肽在药物化学中是一个重要的药效团。目前发现许多环二肽具有强的生理活性，引起了有机化学家、生物学家和药物学家的广泛兴趣。环二肽的报道不多，至今没有查到有关白酒中环二肽的报道。

白酒是中国的国粹，是传统固态发酵的产物，自然接种使大曲和酒糟中存在各种各样的微生物，其中不乏真菌和细菌，尤其是发酵后期以细菌为主，加上传统白酒独特的蒸馏工艺，高沸点的环二肽被带入酒中，成为酒体的一部分。白酒中的环二肽种类很多，已检出20种以上，但通常含量很低，在μg/L级甚至更低，少数在mg/L级，因此用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪测定白酒中的环二肽时需要前处理。

1 材料与方法

1.1 材料

酒样：市售浓香型白酒（53%vol）、清香型白酒（53%vol）、酱香型白酒（53%vol）。

仪器：美国Agilent公司1290系列高效液相色谱仪，6520B系列四级杆飞行时间质谱检测器，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C182.1×100mm 1.8-micron，有机前处理系统一套，SPE C18小柱。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

取白酒样品50 mL，过SPE C18小柱后，甲醇洗脱，洗脱液经有机前处理系统低温浓缩至2 mL，置于干净的进样瓶中，供液相色谱-飞行时间质谱仪进样检测。

1.2.2 样品检测

1.2.2.1 液相色谱条件

分析柱：Agilent Eclipse Plus C182.1×100 mm 1.8-micron；柱温：30℃；流速：0.1 mL/min；进样体积：1μL；流动相：甲醇B（液质级），超纯水A（含0.1%甲酸），0～18 min：10%B-100%B；18.1～26 min：100%B-100%B；26.1～30 min：100%B-10%B；32 min：stop。

1.2.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正模式；检测方式：选择离子检测（SIM）；干燥气温度：300℃；干燥气流量：10 L/min；雾化气压力：40 psig；毛细管电压：3500 V；毛细管出口电压：70 V。

1.3 数据处理方法

质谱经过Agilent MassHunter数据采集工作软件、定性定量分析软件进行数据处理，对于化合物分子式的判定，主要依据m/z、同位素相对丰度、同位素比例等的相似度。分别再经过目标离子（target扫描）的碎片进行目标物的结构判定。

2 结果与分析

2.1 检测结果

2.1.1 酒样分析

通过上述的检测方法，对市售浓香型白酒（53%vol）、清香型白酒（53%vol）、酱香型白酒（53%vol）的3种酒样进行分析，结果见表1。

表1 环二肽名称、分子式、母离子、子离子、碰撞能量

由表1可看出，3种香型的白酒中都存在环二肽，尤其浓香型与酱香型白酒中检出的环二肽的种类更多。

2.1.2 环二肽结构

经过LC-QTOF质谱仪碎片离子峰后，得出的13种环二肽结构式见图1。

2.1.3 二级质谱图

经过LC-QTOF质谱仪碎片离子峰后，3种酒样对应的TIC图及其中每种环二肽对应的二级质谱图，见图2—图17。

2.2 结果讨论与分析

据哈尔滨工业大学食品科学与工程学院的卢曦元、徐德昌等人在《环二肽的生物活性的研究进展》一文中，详细讲述了环二肽的生物活性的作用：细胞间信息传递、抑制毒素、促癌细胞凋亡和镇痛作用等。Rhee等首次提出两种环二肽的协同作用于抑制致病微生物生长和在沙门氏菌中的抗突变作用。这两种环二肽为cyclo(L-Leu-L-Pro)和cyclo(L-Phe-L-Pro)，这种药物组合对物种抗万古霉素的粪肠球菌菌种具有较强的抑制作用；对另外的物种菌种也具有抑制作用，对应的最低抑菌浓度为0.25～0.5 mg/L。Lee等发现由放射诱发的早期肺损伤可以通过浓度为40 mg/kg的cyclo(L-Phe-LPro)减低，并证明cFP对细胞的保护作用于TNF-α、TGF-β1有关，但具体机理未知。KumikoⅢo等证实Cyclo(L-Leu-L-Tyr)(cLY)对天竺鼠缺血后功能障碍具有保护性影响，并与对应的线性肽进行了对比，cLY能够显著增强左心室发展压、左心室舒张末压、冠脉流量和心率等等。李德海等在《海洋放线菌11014中抗肿瘤活性成分研究I.环二肽》一文中采用SRB法测定了13个环二肽的体外抗肿瘤活性，结果表明，化合物环[4-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸)在5 μg/mL时有较强的体外抗肿瘤活性[抑制率为(48.3±3.3)%]，化合物环（亮氨酸-丙氨酸)、环(异亮氨酸-丙氨酸)、环(缬氨酸-丙氨酸)、环(脯氨酸-酪氨酸)、环(脯氨酸-苯丙氨酸)、环(脯氨酸-缬氨酸)具有弱的体外抗肿瘤活性，抑制率分别为(13.1± 5.3)%(5 μg/mL)、(13.84±0.5)%(10 μg/mL)、(24.3± 3.1)%(100 μg/mL)、(15.7±4.2)%(50 μg/mL)、(13.1± 1.9)%(5 μg/mL)、(13.3±1.6)%(5 μg/mL)；同时发现这些环二肽的体外抗肿瘤作用在5～100 μg/mL范围内不具有浓度依赖性，其他化合物未表现出体外抗肿瘤活性。如化合物环(缬氨酸-丙氨酸)、环(脯氨酸-苯丙氨酸)同时具有激活AHI，感应器和诱导生物发光的作用。化合物环(酪氨酸-甘氨酸)，环(脯氨酸-酪氨酸)、环(脯氨酸-缬氨酸)，环(脯氨酸-亮氨酸）具有抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的作用，MIC分别为0.07 μg/mL、0.03 μg/mL、0.05 μg/mL和0.05 μg/mL。

图1 13种环二肽结构式

图2 浓香型白酒全扫描色谱图

图3 清香型白酒全扫描色谱图

图4 酱香型白酒全扫描色谱图

图5 环（丙氨酸-脯氨酸）二级质谱

图6 环（二氨基丁酸）二级质谱图

图7 环（异亮氨酸-缬氨酸）二级质谱图

图8 环（缬氨酸-缬氨酸）二级质谱图

图9 环（脯氨酸-苯丙氨酸）二级质谱图

图10 环（亮氨酸-异亮氨酸）二级质谱图

图11 环（酪氨酸-脯氨酸）二级质谱

图12 环（脯氨酸-亮氨酸）二级质谱图

图13 环（二苯丙氨酸）二级质谱图

图14 环（亮氨酸-丙氨酸）二级质谱图

图15 环（苏氨酸-脯氨酸）二级质谱图

图16 环（苯丙氨酸-丙氨酸）二级质谱图

图17 环（苯丙氨酸-缬氨酸）二级质谱图

通过对3种香型酒样中环二肽的分析研究，不同香型的酒主要由不同的发酵方式、不同的天然微生物（环境造成）而产生不同种类的环二肽物质，不同的环二肽物质具有不同的生理活性。根据文献报道，本文中发现的13种环二肽物质中化合物3、6、7、10、12等都具有多种生理活性，而其余化合物中的生理活性有待进一步的开发研究。肽类化合物，尤其是环肽类化合物有各种各样的生理活性，它们可以是抗生素、毒素、免疫抑制剂、离子转移调节器、蛋白黏合抑制剂、酶抑制剂等。由此可见环二肽的生物活性是非常强大而且具有很强的开发潜力。

3 结语

针对白酒中环二肽物质的分析研究属于首次报道，由于酿酒微生物的分布非常广泛，尤其是一些特殊的老窖泥，“老窖泥”是在特殊的地质、特殊的土壤、特殊的气候条件下，在特定的工艺条件辅助下，通过长期不断培养形成的。其珍贵之处在于通过数百年的沉淀和累积，这些老窖泥中聚集了一个特殊的、专为酿酒所形成的微生物环境，而这个微生物环境中存在高达数百种之多的有益微生物菌群落。另外酿酒原料中含有多种微生物所需的各种营养源，这样为产生环二肽甚至多肽物质提供必要的条件。再加上白酒独特的蒸馏方式造成对这些高沸点物质的拖带作用，从而在白酒中产生。由于环二肽物质多数具有生理活性，通过对环二肽的分析研究，对白酒的健康因子的研究起到很好的提升作用；对白酒中风味物质的剖析有质的变迁，因为过去对白酒风味物质的研究主要倾向于低沸点物质，而环二肽都属于高沸点物质，其熔点多数高于200℃；同时也为酿酒废弃物的综合利用提供更广阔的前景。

[1]卢曦元,徐德昌.环二肽生物活性的研究进展[J].生物信息学,2011(1)：289-291.

[2]李德海,顾谦群,朱伟明,等.海洋放线菌11014中抗肿瘤活性成分的研究I.环二肽[J].中国抗生素杂志,2005 (8)：449-452.

Cyclic Dipeptide Compounds in Baijiu

DENG Xialing,LIAN Shuncai,XIE Zhengmin,LIAO Qinjian,YE Huaxia and ZHANG Qian
(Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644007,China)

In this study,13 kinds of cyclic dipeptide compounds were detected in Baijiu samples by HPLC-QTOF.They were identified as cyclic alanine-proline,cyclic diaminobutyric acid,cyclic lencine-alanine,cyclic isoleucine-valine,cyclic threonine-proline,cyclic proline-phenylalanine,cyclic phenylalanine-alanine,cyclic leucine-isoleucine,cyclic valine-valine,cyclic tyrosine-proline,cyclic phenylalanine-valine,cyclic proline-leucine,and cyclic diphenyl alanine.Among them,cyclic leucine-alanine,cyclic proline-phenylalanine,cyclic phenylalanine-phenylalanine,cyclic tyrosine-proline,and cyclic proline-leucine had multiple physiological activities.

Baijiu;cyclic dipeptide;HPLC-QTOF

TS262.3；TS261.7

A

1001-9286（2017）09-0027-06

10.13746/j.njkj.2017158

2017-06-06

邓霞玲，女，四川宜宾人，高级工程师，四川省白酒评委，金三角白酒评委，主要从事酒体设计、尝评勾兑及酒体分析工作。

练顺才，女，四川宜宾人，教授级高工，主要从事酒类技术研究工作，发表论文数篇。

优先数字出版时间：2017-07-21；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170721.1038.003.html。