1株Wickerhamomyces酵母菌对浓香型白酒发酵的影响

简晓平，简章容，余丽辰，邓骛远，游 玲

(1.四川省宜宾高洲酒业有限责任公司，四川宜宾645178； 2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000)

1株Wickerhamomyces酵母菌对浓香型白酒发酵的影响

简晓平1，简章容1，余丽辰2，邓骛远2，游 玲2

(1.四川省宜宾高洲酒业有限责任公司，四川宜宾645178； 2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000)

为了探究1株Wickerhamomyces anomalus酵母菌对浓香型白酒发酵的影响，将该株酵母菌接种至糟醅中发酵，并分析糟醅的理化性质、风味物质及微生物区系的变化。结果显示，此酵母菌能使糟醅中氨基态氮的含量极显著增加，乙醇显著减少；乙酸生成量极显著减少，正丁醇极显著增加，仲丁醇显著增高，异戊醇、苯甲醇和丁酸乙酯显著减少；增加糟醅中细菌和真菌群体的多样性和丰度，使Sphingobacterium、Botryotinia丰度降低，使Lactobacillus、Xeromyces丰度增加。结果表明，W.anomalus酵母菌对浓香型白酒发酵有着广泛而深远的影响。

Wickerhamomyces； 浓香型白酒； 糟醅理化性质； 风味物质； 微生物区系

浓香型白酒发酵是以糟醅为介质，通过酒曲和窖泥中微生物的共代谢，生成酒精及多种风味物质。其中，酵母作为白酒酿造微生物中的重要类群，在糖化原料、产酒、形成香气物质等方面都起着重要的作用，部分酵母菌株已用于白酒酿造[1]，但现有白酒用商业酵母菌均为酿酒酵母，而已有研究表明，非酿酒酵母可通过分泌多种风味酶促进风味物质生成[2]。Wickerhamomyces anomalus酵母菌作为非酿酒酵母，用于芒果酒、苹果酒及面包发酵，效果均较好[3]；叶萌祺[4]、王益姝[5]的研究表明，其可在高酸度条件下生长良好，生成大量酯类，并且保证生成的酯类不被降解[6]。游玲等[7]从宜宾浓香型白酒产区分离了大量功能酿酒酵母，其中1株W.anomalus酵母菌体现了很好的产酯能力。本研究通过在糟醅中强化接种该酵母，通过糟醅中碳氮转化和风味物质生成情况，探讨此酵母菌对浓香型白酒发酵过程中物质代谢的影响，同时采用高通量测序分析该酵母对糟醅中微生物区系的影响，从产物生成及酿造微生物生态两个方面评价W.anomalus酵母对浓香型白酒发酵的影响，为该酵母的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：从浓香型白酒糟醅中分离得到1株Wickerhamomyces anomalus酵母菌，保藏编号S432Y-42-C（现保存于固态发酵资源利用四川省重点实验室）。

糟醅：由宜宾高洲酒业有限责任公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备

目的酵母菌接种至50 mL YPD液体培养基中活化，再转接至YPD固态培养基上，28℃恒温培养至形成单菌落，然后挑取单菌落接种至YPD液体培养基中，28℃恒温扩培2 d。将扩培后的培养液在8000 r/min条件下，低温离心5 min，取沉淀以无菌水洗涤离心3次后，调节菌体浓度为108个/mL，4℃保存备用。

1.2.2 发酵

固态发酵体系：在浓香型白酒酿造车间，入窖粮糟加1%（v/v）黄水混匀后，分装入1 L的玻璃坛（每坛0.83 kg±0.05 kg），每个玻璃坛接种50 mL菌悬液，充分混匀后封口（封口材料自内向外依次为窖皮泥、坛盖、保鲜膜、牛皮纸）。

混菌处理：添加黄水的糟醅装入玻璃坛后，接种50 mL菌悬液，充分混匀后封口。

纯菌对照：添加黄水的糟醅装入玻璃坛后，1× 105Pa灭菌30 min，冷却至35℃左右接种50 mL菌悬液封口。

空白对照：以等体积的无菌水代替50 mL菌悬液接种未灭菌的糟醅。

处理和对照均设3个重复，室温条件下遮光发酵60 d。

1.2.3 理化指标检测

（1）淀粉含量：通过GB/T 5009.9—2008，采用酶水解法来测定淀粉的含量[8]。

（2）还原糖含量：通过GB/T 5009.7—2008，采用斐林试剂滴定法来测定还原糖的含量[9]。

（3）酸度：通过GB/T 9736—2008，采用滴定分析法来测定酸度[10]。

（4）氨基态氮：通过GB/T 12143—2008，采用甲醛值法来测定氨基态氮的含量[11]。

1.2.4 风味物质及乳酸检测

将固液态发酵样品加入200 mL的去离子水，蒸馏得到100 mL的蒸馏液，所有的蒸馏液均用0.22 μm滤膜过滤备用。

[12]，采用FFAP色谱柱（50×0.25 mm× 0.25 μm，Agilent USA）和LZP-930色谱柱（50 m× 0.25 mm×0.25 μm，郑州普析）检测有机酸及其他主要风味物质，采用C18柱（5 μm，250×4.6 mm）应用液相色谱法检测乳酸含量。

2 结果与分析

遮光处理发酵60 d后，对所有处理及其对照组进行观察测定和分析。以下分别讨论S432Y-42-C酵母对糟醅中碳氮源利用、风味物质生成及微生物区系的影响。

2.1 S432Y-42-C对糟醅中碳氮源利用的影响

白酒发酵过程中，糟醅中糖类物质（特别是还原糖）含量变化直接反映了微生物的生长状况及发酵速度的快慢，蛋白质及氨态氮含量对白酒品质有较大影响，因此对糟醅发酵前后的主要碳氮物质含量进行检测。

S432Y-42-C对糟醅中碳氮源利用的影响见图1。从图1可知，与接种S432Y-42-C酵母菌株的灭菌糟醅相比，混菌糟醅中淀粉、还原糖含量略低，其含量差异都未达到显著水平，而混菌糟醅中乙醇含量显著高于纯菌发酵，可能是因为：第一，强化接种菌株和糟醅微生物共同作用加强了发酵体系糖化酶作用，从而提高了淀粉转化率，导致还原糖生成量多，因此乙醇生成量增多；第二，糟醅灭菌后，由于高温作用，产酒酵母减少，使整个发酵体系发酵力减弱。

图1 S432Y-42-C对糟醅中碳氮利用的影响

与空白对照相比，混菌发酵糟醅中淀粉含量、氨态氮和还原糖略高，残淀含量高于空白糟醅，说明加入强化菌株后降低了淀粉利用率，因此乙醇含量也相应降低，可能是由于加入强化酵母后影响了糟醅的微生物区系，进而影响到糟醅的微生物共代谢网络，使糟醅中糖化酶的产生及作用受到一定抑制。同时，混菌发酵体系中氨基态氮含量极显著高于空白对照组，可能是接种此酵母后促使蛋白酶活性增加，合成氨基态氮的微生物增多。

2.2 S432Y-42-C对糟醅中风味物质含量的影响

2.2.1 S432Y-42-C对糟醅中醇类物质含量的影响（表1）

表1 S432Y-42-C对糟醅中醇含量的影响 (g/L)

由表1可知，与接种S432Y-42-C的纯菌发酵糟醅相比，接种S432Y-42-C的混菌糟醅中5种高级醇生成量均高于纯菌糟醅，并且其中仲丁醇和异戊醇含量差异达到显著水平，正丁醇达到极显著水平，除乙醇外的总醇生成量明显高于纯菌发酵生成量，除此之外，苯甲醇含量显著低于纯菌发酵体系，说明该酵母菌株与糟醅中其他微生物的相互作用倾向于增加高级醇的生成。

与空白对照组相比，混菌发酵糟醅中正丁醇含量极显著高于空白糟醅，除了异戊醇、苯甲醇和正己醇外，其余醇类含量均高于空白糟醅，高级醇总量也明显高于空白组，但是未达到显著水平，由此推测出可能是接种S432Y-42-C酵母菌与发酵体系中酶构成协同作用促进了醇类物质大量生成。

2.2.2 S432Y-42-C对糟醅中有机酸和酯类物质含量的影响（表2、表3）

由表2可知，与接种S432Y-42-C酵母菌株的灭菌糟醅相比，混菌发酵糟醅中乙酸含量极显著低于纯菌发酵，己酸含量略高，丁酸、乳酸含量较低，总酸含量也比较低，但含量差异均未达到显著水平。可能原因是接入了S432Y-42-C酵母菌株对乙酸菌、丁酸菌和乳酸菌产酸有抑制作用，导致相应菌株生成酸量减少。总的来说，糟醅灭菌与否，对产酸量有影响，且乙酸含量差异已达到极显著水平。

表2 S432Y-42-C对糟醅中有机酸含量的影响 (g/mL)

表3 S432Y-42-C对糟醅中酯含量的影响 (g/L)

与空白对照组相比，混菌发酵糟醅酸度略低，总酸含量较低，其中混菌发酵糟醅中乙酸含量显著低于空白糟醅，而对于其他有机酸类物质，尽管表2显示各处理有一定差异，但显著性分析表明各处理间差异均不显著。

由表3可知，与接种酵母菌株的灭菌糟醅相比，混菌发酵糟醅中丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯含量略高，乙酸乙酯含量较低，总酯含量略低，其原因可能是糟醅灭菌后产酸菌减少，酯化酶灭活，并且在高温条件下挥发性酸和醇也导致酯生成量减少，而乙酸乙酯含量较低可能是由于加入的S432Y-42-C菌削弱了乙酸菌的产酸能力，从而生成的乙酸量较少，进而生成的相应酯较少。总体来说，接种此株酵母后，对糟醅中酯的合成有一定程度的影响，但只有丁酸乙酯含量差异达到显著水平。

与空白对照相比，混菌发酵糟醅的乙酸乙酯、乳酸乙酯含量略高，丁酸乙酯、己酸乙酯含量较低，总酯含量略低。其可能是接入的S432Y-42-C菌对整个发酵体系有一定影响，丁酸菌、己酸菌酸化力减弱，酯化力减弱，而增强了乙酸菌、乳酸菌的酯化力，从而使4种主体酯有减有增。由此可见，接种S432Y-42-C酵母菌株对糟醅中4种酯含量和总酯含量均有一定程度的影响，但是均未达到显著水平。

总体来说，混菌发酵糟醅的酸度均比纯菌糟醅和空白对照低，其中混菌中乳酸含量均比纯菌和空白中低，而生成乳酸乙酯含量却均高于纯菌和空白，说明接种该菌株后促使其他风味物质转化成了乳酸乙酯；并且4种主要的有机酸和酯含量均较低，从而说明接种S432Y-42-C酵母菌株后可在一定程度减弱浓香风味。

2.2.3 S432Y-42-C对糟醅中醛类物质含量的影响（见图2）

图2 S432Y-42-C对糟醅中醛类物质含量的影响

由图2可知，与接种S432Y-42-C菌株的灭菌糟醅相比，混菌发酵糟醅中异丁醛、糠醛和乙缩醛含量比较低，而只有乙醛含量略高，可能原因是：第一，纯菌的乙醇含量较少，氧化成乙醛量较低；第二，混菌糟醅中的微生物可能抑制了接种酵母菌株生成醛类物质。总的来说，糟醅不灭菌，对乙醛、异丁醛、糠醛、乙缩醛含量均有影响，但均未达到显著水平。

与空白对照组相比，混菌发酵糟醅中乙醛含量降低了，而异丁醛、糠醛和乙缩醛均升高了，但都未达到显著水平，说明此菌株对醛类物质生成有一定影响，接入此菌株倾向于增加了异丁醛和糠醛生成量，从而可能对白酒产生不良风味。

2.3 S432Y-42-C对糟醅微生物区系的影响

2.3.1 S432Y-42-C对细菌区系的影响（表4）

表4 S432Y-42-C对细菌区系多样性的影响

由表4可知，两个样本的覆盖率均超过92%，能很好地反映糟醅样本中细菌微生物菌群的真实信息。接种S432Y-42-C后糟醅的有效序列数减少，但操作分类单元数增加了，同时香农指数增高了，表明该酵母提高了糟醅中细菌的多样性，即该体系的均匀度提高了，微生物的类群数越高，对于生态系统来说越稳定。

不同分类水平下高通量测序类群数见表5。

表5 不同分类水平下高通量测序类群数

从表5可以看出，接种S432Y-42-C后，糟醅中细菌门从15个增加到22个，并且在纲、目、科、属、种水平上均有较大幅度的增长，造成此现象可能是因为接入的S432Y-42-C菌株破坏了原有的生态平衡，促进本应该衰老的菌株继续分裂生长，从而提高了物种多样性。其中优势门为Firmicutes，优势纲为Bacilli，优势目为Lactobacillales。

S432Y-42-C对糟醅中细菌区系构成的影响见图3。从图3可以看出，接种S432Y-42-C酵母菌株后，优势属Pseudomonas和Sphingobacterium的丰度明显锐减，而Lactobacillus属的丰度大幅度增高了，Kroppenstedtia属丰度也明显增加了，并且也出现了一些其他属，说明此菌株可促进某些属的生长来提高菌体多样性，例如Lactobacillus属。

图3 S432Y-42-C对糟醅中细菌区系构成的影响

2.3.2 S432Y-42-C对真菌区系的影响（表6、表7、图4）

表6 S432Y-42-C对真菌区系多样性的影响

由表6可知，接种S432Y-42-C后糟醅的有效序列数减少，操作分类单元数减少，空白组样本的覆盖率超过99%，能很好地反映糟醅样本中真菌微生物菌群的真实信息，而另一样本的覆盖率超过81%，也能大致反映糟醅样本中细菌微生物菌群的真实信息。同时香农指数和ACE指数变化表明，该酵母增高了糟醅中真菌的多样性及丰富度。

由表7可知，接种S432Y-42-C后，糟醅中真菌纲从21个下降到17个，目从58个下降到37个，科从97个下降到59个，属从144个下降到73个，种从215个下降到96个。其中丰度最高纲是Eurotiomycetes，丰度最高目是Saccharomycetales，丰度最高的种是Zygosaccharomyces pseudobailii。

表7 不同分类水平下高通量测序类群数

图4 S432Y-42-C对糟醅中真菌区系构成的影响

从图4可以看出，接种S432Y-42-C酵母菌株后，优势真菌Botryotinia属大幅度减少，Lodderomyces酵母属消失，而unclassified fungi、Xeromyces等属的丰度不同程度的增高，说明此菌对真菌区系影响较大。

3 结论

根据研究表明，固态发酵的影响因素和不确定因素较多，所以固态发酵不均匀导致数据波动较大。本研究模拟固态发酵，分别从对糟醅碳氮转化、风味物质生成及微生物区系的影响这3个方面探究1株W.anomalus酵母对浓香型白酒发酵的影响，发现：

(1)接种S432Y-42-C酵母对淀粉、还原糖影响不大，对乙醇有显著影响，对氨基态氮有极显著影响，减弱了糟醅发酵力，同时极显著促进蛋白质分解。

(2)该酵母倾向于增加甲醇、仲丁醇、正丁醇、糠醇、异丁醛和糠醛的生成，减少异戊醇、苯甲醇丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸和乳酸的生成，其中仲丁醇、异戊醇、苯甲醇、丁酸乙酯已达到显著水平，而正丁醇和乙酸已达到极显著水平。

(3)接种该酵母后均增加了糟醅中细菌和真菌多样性和丰富度，且对真菌区系影响更大。

因为固态发酵的不均质性，且糟醅中微生物之间的作用较复杂，因此对于上述结论中涉及到的相关现象产生的何种原因、机理还不清楚，后续还需要进行更深一步的探索、研究。

参考文献：

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Effects of a Wickerhamomyces Strain on the Fermentation of Nongxiang Baijiu

JIAN Xiaoping1,JIAN Zhangrong1,YU Lichen2,DENG Wuyuan2and YOU Ling2
(1.Gaozhou Distillery Co.Ltd.,Yibin,Sichuang 645178;2.College of Life Science& Food Engineering,Yibin University,Yibin,Sichuang 644000,China)

In order to explore the effects of a Wickerhamomyces anomalus strain on the fermentation of Nongxiang Baijiu,the strain was inoculated in fermented grains,and the change in physicochemical indexes,flavoring substances and microflora in the fermented grains was analyzed.The results suggested that,the inoculation of the strain could significantly increase the content of amino nitrogen,n-butyl alcohol and sec-butyl alcohol in the fermented grains,and reduce ethanol content,acetic acid yield,isoamyl alcohol,benzyl alcohol and ethyl butyrate.Furthermore,the strain could increase the diversity and abundance of bacteria and fungus in the fermented grains(Lactobacillus and Xeromycess became dominant strains instead of Sphingobacterium and Botryotinia).In conclusion, W.anomalus strain had extensive and deep influence on the fermentation of Nongxiang Baijiu.

Wickerhamomyces;Nongxiang Baijiu;physicochemical properties of fermented grains;flavoring substances;microflora

TS262.3；TS261.1；TS261.4；Q93-3

A

1001-9286（2017）09-0033-06

10.13746/j.njkj.2017194

宜宾学院博士启动项目（2017JJ009）；四川省重点实验室项目（2015GTC001）。

2017-07-11

简晓平(1965-)，男，高级酿酒师，白酒国家级评委，主要从事白酒酿造技术研究。

优先数字出版时间：2017-08-10；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170810.1534.001.html。