高压氧联合谷氨酰胺对创伤性颅脑损伤大鼠神经功能和神经细胞凋亡情况的影响

卢晓闻，陈 哲，许烈鹏，郑云贵，李钦喜，袁 军

(汕头大学医学院第一附属医院神经外科，广东汕头515041)

高压氧联合谷氨酰胺对创伤性颅脑损伤大鼠神经功能和神经细胞凋亡情况的影响

卢晓闻，陈 哲，许烈鹏，郑云贵，李钦喜，袁 军

(汕头大学医学院第一附属医院神经外科，广东汕头515041)

目的:观察高压氧(HBO)联合谷氨酰胺(GLN)对创伤性颅脑损伤(TBI)大鼠神经功能和神经细胞凋亡情况的影响，分析 HBO联合 GLN治疗 TBI的价值和可能机制．方法:将健康雄性SD大鼠(n=50)以Feeney自由落体法建立TBI模型，选取建模成功的大鼠(n=40)作为实验动物，根据干预方式分为4组，即TBI组(普通肠内营养干预，n=10)、TBI+HBO组(普通肠内营养+高压氧，n=10)、TBI+GLN组(谷氨酰胺肠内营养，n=10)、TBI+HBO+GLN组(谷氨酰胺肠内营养+高压氧，n=10)．另选健康雄性SD鼠(n=10)作为健康组．干预后以平衡木实验对大鼠神经功能进行客观评价，用TUNEL法测定各组大鼠神经细胞的凋亡情况，分析组间神经功能和神经细胞凋亡水平的差异．结果:健康组大鼠神经功能评分(0．46±0．04分)、凋亡指数(0．37%±0．09%)显著低于其他各组;TBI+HBO+GLN组大鼠神经功能评分(1．24±0．17分)、凋亡指数(8．83%±0．96%)显著低于TBI组、TBI+GLN组、TBI+HBO组;TBI+HBO组大鼠神经功能评分(2．11±0．42分)、凋亡指数(13．71%±1．41%)显著低于TBI组、TBI+GLN组;TBI+GLN组大鼠神经功能评分(2．96±0．64分)、凋亡指数(18．39%±1．65%)显著低于TBI组，差异有统计学意义(P＜0．01)．结论:HBO联合GLN能够改善TBI大鼠的神经功能，协同产生脑神经保护作用，其作用机制可能与二者能协同抑制神经细胞凋亡有关．

创伤性颅脑损伤;高压氧;谷氨酰胺

0 引言

创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)发生的主要原因为头部遭受外力撞击，其不仅是死亡率最高的脑外伤疾病之一，而且是后遗症最多、最严重的颅脑疾病之一，TBI对患者的损伤极大．临床实践证实，TBI对颅脑的损害不仅局限于受伤瞬间，而且具有继发性演变的特点，在伤后能导致颅脑组织持续恶化损伤．因此，伤后颅脑损害过程是该病的主要病理恶变阶段．神经功能损伤、神经细胞凋亡坏死是继发性颅脑损伤最常见的病理改变，因此，在该阶段进行相关治疗、阻止疾病恶化，对TBI的预后有重要价值．现有研究［1－3］发现，缺氧、营养不足是脑组织损伤恶化的主要促进因素，在继发性脑损伤治疗中及时纠正缺氧、给予充足的营养物质可能有益于患者预后．高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)、营养支持疗法作为目前最主要的两种措施［3－4］，在TBI综合治疗中备受争议，且目前有关二者联合治疗的研究仍极为稀少．本研究在建立TBI模型的基础上，通过动物实验来初步观察HBO联合谷氨酰胺(glutamine，GLN)对颅脑损伤康复的价值，现报道如下．

1 资料和方法

1．1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠，鼠龄20～22周，体质量210～230 g，均购自汕头大学医学院实验动物中心．

1．2 试剂和仪器 高压氧舱(NG90)宁波高压氧舱总厂生产;原位细胞凋亡试剂盒(美国BD公司);纤维照相仪(BX41，日本OLYMPUS公司)、光学显微镜(SZ51，日本OLYMPUS公司);立体定向仪(51725，美国 STOELTING公司);石蜡切片机(a550，德国Leica公司);电子天平(HM-200，日本三洋公司)，微量进样器(10 L，北京博奥森公司);谷氨酞胺(重庆药友制药公司);安素(美国雅培制药公司)．

1．3 方法

1．3．1 TBI动物模型的建立 在胃造口术之后的第7天，成功制作颅脑损伤打击设备后，往大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，按照Feeney操作法［5－6］通过自由落体装置方式制作颅脑损伤动物模型，打击装置部件包括底座，固定架，套管(垂直)、落击锤和撞击垫，造模成功的标记为在自由落体撞击后，被撞击动物右侧Horner征测定结果为阳性［7］．

1．3．2 动物分组 为了保证随机分组和大鼠数目一致，选取50只健康大鼠进TBI模型制作，在成功建模的大鼠中，随机选取40只平衡木实验得分不低于3分的颅脑损伤大鼠作为实验模型动物，按照随机数字表法将其分成4组，并按照干预方案将4组进行区分，分别是TBI组(普通肠内营养干预，n=10)、TBI+ HBO组(普通肠内营养+高压氧，n=10)、TBI+GLN组(谷氨酰胺肠内营养，n=10)、TBI+HBO+GLN组(谷氨酰胺肠内营养+高压氧，n=10)．另选健康雄性SD鼠(n=10)作为健康组，不接受任何干预．

1．3．3 HBO治疗 造模成功后的3 h之内，TBI+ HBO组、TBI+HBO+GLN组大鼠进入高压舱接受HBO治疗，氧舱型号均为NG90，给氧方式为直排式，氧浓度不低于98．5%，压力为0．15 Mpa，稳压吸氧时间为60 min．连续治疗14 d．

1．3．4 肠内营养干预 所有大鼠在造模后均接受营养支持治疗，营养支持方式均为肠内营养，营养制剂均为安素，其中蛋白质占比14．2%，脂肪占比31．8%，碳水化合物占比54．0%，渗透压浓度379 mOsm/L，热量供给标准142．97 Kcal/kg．第一日半量补给，第二日开始全量补给，每日补给2次，连续7 d．TBI+GLN组、TBI+HBO+GLN组在给予安素肠内营养的同时，每日添加1．0 g/kg的GLN．两组均连续干预14 d．

1．4 检测指标

1．4．1 平衡木实验 选一根长度1．0 m、宽度3．0 cm、厚度1．5 cm的横木，将其水平放置在离地50 cm的空中，将大鼠依次通过悬空横木，在造模前3 d对所选大鼠进行横木通过训练，确保大鼠可顺利自行通过以后，开始试验．放置横木，使大鼠在其上顺利行走．术前3 d开始训练，保证大鼠均可以顺利通过横木．神经功能评分标准:0分:可自由穿过横木，中途无跌倒;1分:能够自行穿过横木，有滑脚现象的路程在50%以下;2分:能穿过横木，有滑脚现象的路程不低于50%;3分:能穿过横木，且瘫痪肢无法向前移动; 4分:虽然无法穿过横木，但能坐于横木上;5分:在横木上不能维持平衡．每只大鼠均测试3次，取平均值为结果［8］．

1．4．2 细胞凋亡检测 干预之后对各组大鼠再次称重，用水合氯醛腹腔麻醉后，将受试模型以仰卧位固定在实验台上．调试灌注装置，常规开胸并分离心包，将心尖部心肌剪开，以左心室为起点，将灌注针头插到升主动脉内，将灌注针头固定，启动灌注器，接通右心耳，将200 mL生理盐水(37℃)快速灌注到循环系统中．将循环血液冲洗干净后，即快速灌注150 mL多聚甲醛磷酸盐缓冲液(浓度4%，温度40℃)，再缓慢灌注缓冲液(250 mL)，灌注2 h;灌注结束后，断头获取损伤部位脑组织，健康组取相应部位组织，常规进行多聚甲醛磷酸盐液固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石腊包埋后，以冠状切片形式完成切片制作，每组均选6只鼠接受细胞凋亡检测 ，细胞计数方法为TUNEL法，操作依据TUNEL试剂盒内所附带的说明书．TUNEL阳性标准［9］是胞核为棕黄色．本研究中所有模型鼠均选取5个高倍镜(400倍镜下)进行阳性细胞计数，最终结果为5个视野的平均阳性数量，凋亡指数计算公式［10］为:凋亡指数=阳性细胞数/细胞总数×100%．

1．5 统计学处理 采用CHISS9．4统计学软件对数据进行分析，计量资料用x ±s，多组间比较用单因素方差分析，多重比较用最小显著差数法，P＜0．05表示差异有统计学意义．

2 结果

2．1 各组间大鼠神经功能评分结果比较 干预2周后，各组将死亡大鼠剔除后，进行平衡木实验．5组大鼠平衡木测试结果显示，健康组大鼠均能够自行通过横木，偶有滑脚现象出现．脑损伤各组均有模型鼠出现了明显滑脚现象，TBI组模型鼠平衡木评分最高，其次为TBI+GLN组，TBI+HBO组和TBI+HBO+GLN组评分相对较低，尤其是TBI+HBO+GLN组评分集中在1～2分．多重比较结果显示，健康组、TBI组、TBI+ GLN组、TBI+HBO组、TBI+HBO+GLN组神经功能评分差异有统计学意义(P＜0．05，表1、2)．

表1 各组间大鼠神经功能评分结果比较 (x ±s)

表2 多重比较结果显示

2．2 各组间大鼠神经细胞凋亡情况比较 干预2周后，各组的标本切片经过TUNEL法对凋亡神经细胞进行计数后，均按照公式完成了凋亡指数计算．本研究中各组均发现凋亡神经细胞的存在，但是脑损伤各组神经细胞凋亡更严重，其中TBI组凋亡神经细胞最多，其凋亡指数最高，然后依次为TBI+GLN组、TBI+ HBO组、TBI+HBO+GLN组，健康组神经细胞凋亡指数最低．多重比较结果显示，健康组、TBI组、TBI+ GLN组、TBI+HBO组、TBI+HBO+GLN组凋亡指数差异有统计学意义(P＜0．05，表3、4)．

表3 各组间大鼠凋亡指数计算结果 (n=6，x ±s，%)

表4 多重比较结果显示

3 讨论

TBI被认为是创伤疾病中死亡率最高的类型．虽然现代医疗技术不断进步，急救效果不断提高，但颅脑损伤死亡风险却无明显降低．另外，虽然绝大多数颅脑损伤患者无生命危险，但往往存在神经功能损伤的后遗症，这对患者生活质量影响极大．因此，积极提升TBI患者的预后、改善神经功能、降低死亡率一直受到临床医生的重视．研究发现，TBI的患者多存在缺血缺氧、营养缺乏的现象，加之神经细胞凋亡导致继发性脑损伤，这些因素是疾病恶化的主要原因．虽然细胞凋亡属于正常的细胞死亡形式，其与机体细胞自杀程序有关，但现有研究［11－12］证实，颅脑损伤后神经细胞凋亡对颅脑损伤继发性损伤演变过程具有重要影响，而干预神经细胞凋亡对神经功能、预后效果改善有重要作用．

众所周知，神经细胞的存活及功能与氧具有密切关系，加之神经细胞具有高度氧依赖性，脑内能量代谢过程全部属于有氧代谢，因此，一旦脑组织缺氧，氧储备量减少，脑组织代谢过程将会出现明显障碍，生物能量区域衰竭，这会导致脑组织血液、能量循环终止，神经细胞则开始凋亡．因此，通过外源性提高氧浓度，有利于挽救具有潜在凋亡风险的神经细胞．HBO治疗是目前新型外源性提高氧浓度的方式，且国内外研究［13－15］均已证实高压氧疗法能够提高脑外伤治疗的效果．神经细胞凋亡不仅与氧浓度相关，而且与营养水平关系密切．颅脑损伤发生后，基于缺血缺氧状态，糖代谢、脂代谢等均发生异常改变，体内血糖水平迅速提升后，脑损害程度加重，并诱发细胞酸中毒．此外，颅脑损伤后，内脂质过氧化效应增强，氧自由基生成水平提升，也能够对神经细胞产生毒害作用．相关研究显示营养支持疗法对于颅脑损伤康复具有重要意义．它不仅能够改善患者营养水平，而且部分营养素能通过刺激免疫细胞产生免疫调节作用，增强机体抗感染能力，最终提升患者预后．GLN作为氨基酸、核酸、蛋白质复合底物，是目前公认的免疫型营养素［16－17］．其不仅能够发挥类葡萄糖作用(供能)，而且其作为核酸合成前体，是免疫细胞、组织细胞获得能量的源泉．在损伤状态下，机体对GLN的需求大幅升高，及时补充GLN能够防止肠黏膜屏障受损，维持免疫功能，对颅脑损伤预后具有促进作用［18］．虽然目前关于HBO联合GLN治疗颅脑损伤的价值已被证实［19］，但是在细胞层次的作用机制研究却较为少见，因此本研究立足于细胞学研究层次，通过分析神经功能、神经细胞凋亡情况初步分析HBO联合GLN治疗TBI的效果和可能机制．

本研究结果显示，健康组神经功能评分、凋亡指数最低，其中凋亡指数并非为0，说明在正常情况下，神经细胞由于自杀程序也可发生凋亡，这与细胞周期变化、除旧生新有关．颅脑损伤各组神经功能评分、凋亡指数均明显高于健康组，说明颅脑损伤能够导致神经功能缺损，加大神经细胞凋亡幅度．经过干预，TBI+HBO+GLN组神经功能评分、凋亡指数均低于TBI组、TBI+GLN组、TBI+HBO组，且TBI+HBO组与TBI+GLN组神经功能评分、凋亡指数均低于TBI组，说明与常规肠内营养支持相比，加用GLN或者HBO均能够提升神经功能恢复效果，但是HBO联合GLN对于神经细胞凋亡的阻滞效果更佳，考虑其机制可能有几下几点:①GLN具有抗炎作用，能够对炎症因子进行直接抑制;②GLN能够促进谷胱甘肽生成，提升氧自由基清除效果，从而发挥神经保护作用;③HBO能够对细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、白介素等产生抑制作用，减轻炎症反应，提高脑组织中氧浓度，从而减轻脑损伤;HBO能稳定细胞内Ca2+浓度，能够预防钙超载、氨基酸兴奋性异常增加而引发的神经细胞坏死，并且能够促进骨髓间充质干细胞向成熟神经细胞分化;HBO提高椎基底动脉血供，阻断脑缺血-水肿循环，激活上行网状激活系统［20］．HBO治疗能够改善脑部血流动力学指标，增加脑部血供，有利于改善脑组织营养水平．由于本研究尚未对不良反应进行观察，且属于动物实验阶段，关于HBO联合GLN的临床价值仍有待深究．HBO联合GLN能够改善TBI患者神经功能，其作用机制可能为二者可联合抑制神经细胞凋亡．

［1］邓 睿，赵凤艳，张 莉，等．新生大鼠缺氧缺血脑损伤时脑组织STAT3信号通路的作用［J］．中国当代儿科杂志，2016，18(1):78－84．

［2］包 龙，徐 峰，凌伟华，等．创伤性颅脑损伤患者:急性胃肠损伤与营养支持--基于欧洲危重病医学会关于急性胃肠损伤定义及处理指南的思考［J］．中国急救医学，2013，33(9):793－796．

［3］Palzur E，Vlodavsky E，Mulla H，et al．Hyperbaric oxygen therapy for reduction of secondary brain damage in head injury:an animal model of brain contusion［J］．J Neurotrauma，2004，21(1):41－48．

［4］Fu X，Zhu M，Sun X，et al．Hyperbaric oxygen treatment and enteral nutrition support with glutamine relieves traumatic brain injury in the rats［J］．Int J Clin Exp Med，2014，7(12):5686－5690．

［5］李茂林，王祝峰，章 薇，等．红景天苷对大鼠颅脑损伤的保护作用研究［J］．中华神经外科疾病研究杂志，2016，15(2):128－131．

［6］Dail WG，Feeney DM，Murray HM，et al．Responses to cortical injury:II．Widespread depression of the activity of an enzyme in cortex remote from a focal injury［J］．Brain Res，1981，211(1):79－89．

［7］尹延庆，方 琦，廖壮槟，等．灯盏花素对创伤性脑损伤模型大鼠脑组织中蛋白激酶C-γ表达的影响［J］．中国组织工程研究，2015，19(49):7926－7931．

［8］马 青，李 亚，唐民科．线叶金雀花对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］．北京中医药大学学报，2017，40(3):193－199．

［9］朱岁军，刘 晨，王 俊，等．早期常压高氧治疗对大鼠颅脑损伤后线粒体功能及细胞凋亡的影响［J］．中华危重症医学杂志:电子版，2015，8(1):17－23．［10］徐 燊，刘家传，王春琳，等．缺氧预处理对大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的影响［J］．中华神经医学杂志，2016，15(5): 452－457．

［11］谭 玲．高压氧对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡及NF-κB表达的影响［J］．四川医学，2015，36(8):1099－1102．

［12］李 明，殷玉华，江基尧．急性脑损伤后神经细胞凋亡机制的研究进展［J］．实用临床医药杂志，2013，17(7):156－159．

［13］Chazalviel L，Haelewyn B，Degoulet M，et al．Hyperbaric oxygen increases tissue-plasminogen activator-induced thrombolysis in vitro，and reduces ischemic brain damage and edema in rats subjected to thromboembolic brain ischemia［J］．Med Gas Res，2016，6(2):64－69．

［14］Lu Y，Kang J，Bai Y，et al．Hyperbaric oxygen enlarges the area of brain damage in MCAO rats by blocking autophagy via ERK1/2 activation［J］．Eur J Pharmacol，2014，728:93－99．

［15］修光辉，李秀玲，朱义超，等．高压氧治疗对急性脑外伤大鼠神经行为学及CREB表达的影响［J］．中国医学创新，2016，13(12):5－9．

［16］Ramadan S，Lin A，Stanwell P．Glutamate and glutamine:a review of in vivo MRS in the human brain［J］．NMR Biomed，2013，26(12):1630－1646．

［17］李亚松，陈祥荣，邬树凯，等．谷氨酰胺抑制内质网应激反应改善大鼠创伤性颅脑损伤后神经功能［J］．中华临床营养杂志，2017，25(1):47－52．

［18］王 瑾，陆新健，郑 康，等．谷氨酰胺对脓毒症大鼠脑功能的保护作用［J］．临床麻醉学杂志，2013，29(3):271－274．

［19］付宪华，方大钊，董 楠，等．高压氧联合谷氨酰胺治疗大鼠创伤性颅脑损伤的研究［J］．中华航海医学与高气压医学杂志，2013，20(4):228－231．

［20］周苏键，彭慧平．高压氧对脑损伤后神经功能恢复作用的研究进展［J］．吉林医学，2015，36(4):742－744．

Effect of hyperbaric oxygen combined with glutamine on neurological function and neuronal apoptosis in traumatic brain injury of rats

LU Xiao-Wen，CHEN Zhe，XU Lie-Peng，ZHENG Yun-Gui，LI Qin-Xi，YUAN Jun
Department of Neurosurgery，First Affiliated Hospital of Medical College，Shantou University，Shantou 515041，China

AIM:To investigate the effect of hyperbaric oxygen (HBO)combined with glutamine(GLN)on neurological function and neuronal apoptosis in traumatic brain injury(TBI)in rats and analyze their value and potential mechanisms in the treatment of TBI．METHODS:Fifty healthy male adult SD rats were used to establish TBI model by the free-fall method and forty of them were selected into the experiment．Selected rats were randomly divided into 4 groups:the TBI group(n=10)，the TBI+HBO group(n= 10)，the TBI+GLN group(n=10)，and the TBI+HBO+GLN group(n=10)．In addition，10 healthy adult male SD rats were picked as healthy group．After intervention，the neurological function of the rats was evaluated by beam balance test，and the neuronal apoptosis of rats was evaluated by in situ end labeling(TUNEL)．The difference on neurological function and neuronal apoptosis of different groups were compared and analyzed．RESULTS:The neurological function score(0．46±0．04)and the neuronal apoptosis rate(0．37%±0．09%)in healthy group were significantly lower than that of other groups(all P＜0．01);The neurological function score(1．24±0．17)and the neuronal apoptosis rate(8．83%± 0．96%)in TBI+HBO+GLN group were significantly lower than that of TBI group，TBI+GLN group and TBI+HBO group(all P＜0．01);The neurological function score(2．11±0．42)and the neuronal apoptosis rate(13．71%±1．41%)in TBI+HBO group were significantly lower than that of TBI group and TBI+GLNgroup(all P＜0．01);The neurological function score(2．96± 0．64)and the neuronal apoptosis rate(18．39%±1．65%)in TBI+ GLN group were significantly lower than that of TBI group，with statistically significant differences(P＜0．01)．CONCLUSION: HBO combined with GLN could effectively improve neurological function and protect neurons in the treatment of TBI，which may be related to synergistic inhibition of neuronal apoptosis．

traumatic brain injury;hyperbaric oxygen;glutamine

R459．6;R651．1+5

A

2095-6894(2017)08-29-05

2017－06－19;接受日期:2017－07－08

广东省自筹经费类科技计划项目(2016ZC0167)

卢晓闻．硕士，主治医师．研究方向:脑血管病、脑肿瘤、脑外伤．E-mail:evanlxw@163．com

陈 哲(并列第一作者)．研究生．研究方向:脑血管病、脑肿瘤、脑外伤．E-mail:17246622@qq．com

袁 军．博士，副主任医师，副教授．研究方向:脑血管病、脑肿瘤、脑外伤．E-mail:yjun116@163．com