一种巴尔喀什蘑菇发酵料腐生菌的鉴定及其生物学特性研究

努尔孜亚·亚力买买提，魏鹏，贾培松，罗影，郝敬喆，贾文捷

(农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091)

一种巴尔喀什蘑菇发酵料腐生菌的鉴定及其生物学特性研究

努尔孜亚·亚力买买提，魏鹏，贾培松，罗影，郝敬喆，贾文捷

(农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室/新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091)

【目的】制作巴尔喀什蘑菇培养料生产过程中，常发现一种腐生菌引起的病害，表现为棉籽壳发酵料发酵温度持续偏低，料面湿滑。研究该病害的病原和生物学特性，为该病害的有效控制提供依据。【方法】分离得到病原菌，观察形态特征和分析rDNA-ITS序列。【结果】该病原菌为粉红菌寄生菌(Hypomycesrosellus)的分生孢子阶段Cladobotryumnoes菌寄生所致巴尔喀什蘑菇粉红菌病。该病原菌菌丝体最佳生长条件为20℃，属低温菌，pH 5.5偏酸性生长。葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，光照对菌丝体生长有一定抑制作用。【结论】在食用菌生产过程中前期严格控制温度条件，做好二次发酵，加强通风和环境卫生管理有助于预防巴尔喀什蘑菇红菌病害发生。

巴尔喀什蘑菇；发酵料；腐生菌鉴定；粉红菌；生物学特性

0 引 言

【研究意义】巴尔喀什蘑菇是新疆特有的野生食用菌品种，主要生长在中亚地区内陆湖泊附近[1]，我国新疆部分地区有分布[2],目前还未能大规模人工栽培。【前人研究进展】培养草腐菌巴尔喀什蘑菇、双孢菇等栽培食用菌常常受到病害的侵扰，大多数致病真菌是霉菌类，具丝状菌丝。这些病原真菌除腐生外，还具有不同的寄生性，多喜高温、高湿和酸性环境，其中疣孢霉引起的褐腐病、轮枝霉引起的干泡病、轮指孢霉引起的软腐病、头孢霉引起的褶霉病、镰孢霉引起的猝倒病等为当地多见常发病害[3]。严重影响栽培的食用菌产量和品质。【本研究切入点】2014年底，在阜康市职业技术学校双孢菇生产实验基地，驯化巴尔喀什蘑菇试验时，发生了一种病害，该病害的症状表现为，棉籽壳培养料发酵时料温较低，料内中心最高温度仅60℃。将培养料置于栽培床上，料面湿滑有一层水渍，并伴有氨气状腥臭味。巴尔喀什蘑菇与双孢菇菌种在培养料表面正常萌发，但前期萌发菌丝向培养料内走菌缓慢或停滞生长，菌丝细弱，到生长后期料温升高蘑菇菌丝发育能基本恢复正常。研究该病害的病原和生物学特性。【拟解决的关键问题】研究该病害的病原菌种类与其发生危害程度，分析病原学及其生物性质，为科学防治该病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

病原菌分离自巴尔喀什蘑菇培养料棉籽壳。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL。通常称PDA培养基。

马铃薯加富培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蛋白胨8 g，水1 000 mL。也称PDA加富培养基。

基础培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

基础加富培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨8 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB1 10 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 杀菌剂

50%咪酰胺锰盐可湿性粉剂(上海生农生化制品有限公司)、 50%苯菌灵可湿性粉剂(台湾兴农中国有限公司)、70%甲基托布津可湿性粉剂(江苏龙灯化学有限公司)、75%百菌清可湿性粉剂(江苏科宁利民化工有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离纯化

首先，在无菌条件下，用无菌水轻轻冲洗发病巴尔喀什蘑菇棉籽壳培养料3遍后，用灭过菌的滤纸吸干棉籽壳表面水分，将棉籽壳接种到PDA 培养基上，贴上封口膜后倒置于25℃恒温箱中黑暗培养，待长出菌落后进行单孢分离纯化，获得纯培养物，并进行菌种fbj-1保藏[4]。

1.2.2 病菌rDNA ITS 序列测定

(1)总DNA 的提取：采用CTAB 法提取病原菌菌丝体的总DNA。

(2)rDNA ITS序列测定和分析：ITS 序列扩增选用真菌通用引物[5]。

PCR 反应体系(25 μL)：17.7 μL 双蒸DD无菌水，2 μL 10×buffer，2 μL dNTP，引物ITS1 和ITS4 各1 μL，1 μL 模板DNA，0.3 μL Taq 酶。PCR 反应条件：94℃预变性5 min，然后94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，扩增35 个循环，最后72℃延伸10 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果在GenBank(NCBI，http://www.ncbi)对比，经GenBank 中Blast 后，下载与本序列最相近的序列以及其他相关真菌序列共6条(表1)，经MAFFT v7.037b进行序列比对及手工校正后，保存为FASTA 格式[6]。使用MrBayes 3.2 进行贝叶斯推理法(BI)分析[7]。同时在软件MEGA 6中采用邻近归并法(neighbor joining)经1 000次bootstrap 验证构建系统发育树[8]。

1.2.3 病原菌生物学特性

1.2.3.1 温度

将病原菌在PDA平板上培养5 d 后，用经灭菌的直径5 mm 的打孔器打取菌落圆片，将菌落圆片接种在直径9 cm 的PDA 平板上，置于不同温度下恒温培养。温度设置为5、10、15、20、25、30和35℃ 等7 个梯度，培养4 d 后采用划“十”字法测量菌落直径，计算菌丝体生长速度，每个处理4次重复。

1.2.3.2 pH 值

在无菌条件下用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节PDA 的pH 值，pH值设置为：3.5、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 碳源

以马铃薯加富培养基与基础培养基为对照，分别用蔗糖、麦芽糖、淀粉来代替葡萄糖作为处理组。方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 氮源

以马铃薯加富培养基与基础培养基为对照，分别用酵母粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠来代替蛋白胨作为处理组。方法同1.2.3.1。

1.2.3.5 光照

将1.4.1 制得的菌落圆片接种在PDA 平板上，置于25℃光照培养箱中，分别设完全光照和完全黑暗两个处理，培养4 d后采用划“十”字法测量菌落直径，计算菌落生长速度，每个处理设4次重复。

1.2.4 致病性测定

平板对峙培养：在PDA平板培养基表面一端相隔5cm距离先接种双孢菇菌株，3 d后菌株萌发定植后，接目标菌株fbj-1。在25恒温箱中黑暗培养，观察菌落之间有无抑菌带以及抑菌带的宽度和拮抗方向等。

1.2.5 杀菌剂抑菌性测定

以PDA为培养基定量分装于三角烧瓶内灭菌"待培养基冷却至50℃左右时分别加入咪酰胺锰盐、苯菌灵、甲基托布津和百菌清可湿性粉剂，各药剂浓度稀释1 000倍，摇匀后倒入培养皿。待凝固后分别接直径为 5 mm的粉孢菌菌块。以不加杀菌剂的培养基作空白对照。每一处理重复4次。接种 5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算病原菌菌丝生长抑制率。

2 结果与分析

2.1 病菌培养特性及形态特征

病菌在PDA 上生长迅速，培养3 d后直径4～5 cm，菌落粉红色，表面蜡质，背面变黄(图1A)。菌丝发达，纤细，具有隔膜(图1B)。分生孢子梗枝状分枝，芽殖单生产孢(图1C)。分生孢子单生或成聚生，分生孢子卵圆形，单胞或双胞，无色，大小为8～10 μm×18～20 μm(图1D)。未见有性世代出现。形态鉴定该病菌为葡枝霉属Cladobotryumnoes真菌属粉红菌[9]。

(A)病原菌菌落形态；(B)菌丝体形态(10X10)；(C)孢子梗与分生孢子(10X16)；(D)分生孢子(10X40)

A: Colony on PDA；Bmycelium(10X10);C： Conidiophores and conidia (10X16);D: conidias (10X40)

图1 粉红菌寄生的菌落和形态特征

Fig.1 Colony and morphology of Cladobotryum sp.

2.2 病原菌rDNA ITS 序列

基于ITS-5.8S rDNA 序列，扩增和凝胶电泳检测，获得大小约600 bp 的片段。经测序测试，确定供试菌株fbj-1(EC5DKXBJ016) 的rDNA ITS 片段长度为591 bp。经与GenBank中相关基因序列进行同源性比对，菌株fbj-1 与金黄菌寄生Hypomycesaurantius(KM509060.1 和FJ442642.1)的DNA 同源性达到97%以上。表1

通过系统发育分析，供试菌株序列与Cladobotryummycophilum和Hypomycesodoratus在同一分支上属Cladobotryumnoes粉红葡枝霉。图2

表1 基因序列同源性比对

Table 1 results of gene sequence homology comparison

菌株类型Description相似率Ident(%)GenBank登录号GenBankAccessionNo．寄主Host金黄寄生菌Hypomycesaurantius97KM509060 1斑玉蕈Hypsizygusmarmoreus金黄寄生菌Hypomycesaurantius98FJ442642 1双孢蘑菇Agaricusbisporus金黄寄生菌Hypomycessubiculosus98EU280093 1双孢蘑菇Agaricusbisporus树状葡枝霉Cladobotryummycophilum91JF693809 1双孢蘑菇AgaricusbisporusHypomycesodoratus90KX098650 1树状葡枝霉Cladobotryumprotrusumi90KU237239 1双孢蘑菇Agaricusbisporus

标尺0.5 为进化距离

scale 0.5 is evolutionary distance

图2 基于rDNA ITS 序列构建的fbj-1系统发育树

Fig 2 fbj-1 phylogenetic tree constructed based on rDNA ITS sequence

2.3 病菌生物学特性

2.3.1 温度对菌丝体生长的影响

研究表明，该菌在不同的温度下生长速度存在显著差异。该菌在5～35℃内均可生长，最适温度为20℃。当温度达到40℃时菌丝体停止生长。

2.3.2 pH 值对菌丝体生长的影响

研究表明，该菌在pH 4.5～10 的范围内均可生长，最适pH为5.5。当pH达到10以后，菌丝体停止生长。病菌菌丝体在酸性条件下生长良好。

2.3.3 碳源对菌丝体生长的影响

研究表明，该病菌对供试4种碳源均能利用，其中以葡萄糖为最好，其次为蔗糖和淀粉，对麦芽糖利用较差。

2.3.4 氮源对菌丝体生长的影响

研究表明，病菌对除尿素以外的其他4种氮源均可利用，以蛋白胨效果最佳，酵母粉和硫酸铵次之，硝酸钠较差，尿素几乎不利用。

2.4 致病性测定

经对峙测定，发现靠近蘑菇菌落处，双孢蘑菇菌丝变白浓密，似乎形成拮抗线。显微观察显示两者菌丝间未发现相互缠绕的绞杀现象，呈现出菌丝间的交叉重叠。二者是对营养和空间的竞争关系属于竞争性杂菌。图3

A：双孢菇菌丝；B：病原菌菌丝

A:Agaricusbisporus; B:Cladobotryum

图3 双孢菇菌落与病原菌菌落对峙培养形态

Fig.3 Stand facing each other colony with pathogen and Agaricus bisporus

2.5 杀菌剂对病原菌粉孢菌菌丝生长的影响

4种杀菌剂对病原菌菌丝均有一定的抑制作用，其中咪酰胺锰盐抑菌效果最好达73.73%，其次是苯菌灵和甲基托布津，抑菌成果均亦达到37%以上。百菌清抑菌效果不明显仅有16.19%。差异性分析发现，不同杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制作用呈现显著性差异。

表2 4种杀菌剂下病原菌菌丝生长变化

Table2 Effects of 4 fungicides on the growth of mycelium of pathogenic bacteria

杀菌剂名称菌落直径IIIIIIIV菌丝生长抑制率(%)差异显著性0．050．01咪酰胺锰盐1 251 501 361 2073 63dD苯菌灵3 182 813 022 8741 01cC甲基托布津3 102 953 303 2137 64bB百菌清4 084 154 404 2516 19aACK4 934 855 165 20---

3 讨 论

巴尔喀什蘑菇是中亚地区包括我国新疆内陆湖畔红柳和芦苇等腐殖层下生长的一类大型食用菌，通常在每年的春秋两季形成硕大的子实体。子实体通常埋生在地表下30～50 cm，很少暴露地面[1]，目前该菌尚不能人工栽培。实验以棉籽壳为主要栽培基质培养巴尔喀什蘑菇，采用培养双孢菇的开放式栽培方式。培养料通过自然发酵，改变内部营养成分和消除杂菌[10-11]。由于环境和人为因素的影响形成二次污染。竞争性病害葡枝霉病在培养料表面可形成圆形的浓密白色粉状菌丝区，偶尔侵染床面上残留子实体，形成红色或黄色的病菇，最终变成黑色或褐色，腐烂[12]。该病分布于有机质丰富的有机残体中，在温度20～30℃，菇房湿度90%以上时易发病，可为害茶树菇、滑子菇、杏鲍菇多种食用菌[13]，已在欧洲、美洲和亚洲等地区都有报道，是一种世界性病害应引起双孢菇生产部门高度重视。药剂防治栽培食用菌竞争性杂菌，先了解感染蘑菇的病原菌对它的的敏感性非常重要，选择高效低毒低残留的杀菌剂用于控制食用菌竞争性杂菌[14]。咪酰胺锰盐、苯菌灵和甲基托布津对防控粉孢菌有较好的防效，其中防腐保鲜剂咪酰胺锰盐防效达73.63%并且残留低可以推荐使用。百菌清对该病原菌防治效果较低不敏感。物理防治有效的蒸汽蒸煮是目前防治该病原菌最好的方法，目前双孢菇栽培场所推广的二次发酵和三次发酵技术可以防控该病害发生。

4 结 论

分离得到的病原菌通过对峙实验表明属于竞争性杂菌。通过组织形态学观察与rDNA ITS 序列分析可以判断是属于葡枝霉菌的无性型阶段粉孢菌Cladobotryumnoes。该病原菌的菌丝体生长阶段最适生长条件是，温度20℃，pH 5.5属低温菌。最适碳源葡萄糖，最适氮源蛋白胨。防腐保鲜剂咪酰胺锰盐防效达73.63%并且残留低，蘑菇栽培期间对该病害的防控应在蘑菇生产过程中前期严格控制温度湿度，净化环境条件，做好二次发酵工作，同时加强通风和环境卫生管理有助于预防该病害发生。

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BiologicalCharacteristicsofCladobotryumsp.parasiticonFermentMaterialofAgaricusbalchaschensis

Nurziya Yalimaimaiti, WEI Peng，JIA Pei-song, LUO Ying, HAO Jing-zhe, JIA Wen-jie

(KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCorpVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgricultureSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 The new disease is always found in the production process ofAgaricusbalchaschensiscultivation, which results in continuous low fermentation temperature and wet surface. This project aims to study the pathogen and biological characteristics of the disease in order to provide basis for more effective control.【Method】Through morphological observation and its rDNA sequence analysis to obtain pathogenic bacteria.【Result】The pathogenic fungus was determined to be Cladobotryum.sp. Through the study on the biological characteristics of the pathogenic bacteria, it was found that its mycelium best growth conditions was 20℃ low temperature bacteria, acidic pH5.5 growth，glucose was its carbon source, peptone was nitrogen source, and light had a certain inhibitory effect on mycelial growth.【Conclusion】The prevention and control of the disease should be strictly controlled by the temperature condition in the early stage of the production of edible fungi, and the two fermentation work should be carried out. At the same time, strengthening the ventilation and environmental sanitation management will help prevent the disease.

Agaricusbalchaschensis; ferment material; identification of saprophytic bacteria,Cladobotryumsp. ; biological characteristics

JIA Wen-jie(1969-)，(E-mail ) 1612367472@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.015

2017-05-10

国家自然科学基金项目(31560577); 国家现代农业产业技术体系项目( CARS-24)

努尔孜亚·亚力买买提(1977-)，女，新疆伊犁人，助理研究员，研究方向为栽培食用菌种质资源保藏与病虫害防控，(E-mail)823037554@qq.com

贾文捷(1969-)，男，河北邢台人，农艺师，研究方向为食用菌栽培，(E-mail)1612367472@qq.com

S188

：A

：1001-4330(2017)08-1489-07

Supported by: Supported by Natural Science Foundation of China (31560577) ；Supported by China Modern Agricultural Industry Technology System (CARS-24).