新疆红枣软腐病病原菌的鉴定

白剑宇，宋峰惠，吴正保，刘正兴，崔燕华，史彦江

(1.新疆农业大学林学与园艺学院博士流动站，乌鲁木齐 830052；2.新疆林业科学院经济林研究所，乌鲁木齐 830063；3.阿克苏地区农业技术推广中心，新疆阿克苏 843000)

新疆红枣软腐病病原菌的鉴定

白剑宇1,2，宋峰惠2，吴正保2，刘正兴3，崔燕华3，史彦江2

(1.新疆农业大学林学与园艺学院博士流动站，乌鲁木齐 830052；2.新疆林业科学院经济林研究所，乌鲁木齐 830063；3.阿克苏地区农业技术推广中心，新疆阿克苏 843000)

【目的】鉴定枣软腐病的致病病原，为有针对性的开展病害防治奠定基础。【方法】采用病原菌常规分离技术获取疑似病原物，通过形态学特征和回接验证对病原进行鉴定；利用PCR技术获取病原菌的ITS基因的序列片段，通过与GenBank中已有的相关序列进行比对分析，构建遗传进化树，结合形态学鉴定和致病性实验验证，鉴定病原。【结果】新疆枣软腐病病原的形态学特征与米根霉(Rhizopusoryzae)相似。枣软腐病的病原与GenBank中已知的米根霉菌株的ITS序列显示99%～100%的相似性，在遗传进化树分析中并聚在同一组。【结论】基于形态学特征、致病性试验以及分子鉴定结果，新疆枣软腐病病原被鉴定为Rhizopusoryzae。

枣软腐病；rDNA-ITS；病原鉴定；遗传进化树分析

0 引 言

【研究意义】红枣(ZiziphusjujubeMill.)在中国因其对干旱和土壤pH值的广泛适应性以及其保健作用而收到广大消费者的欢迎[1]。近年来，红枣在南疆地区广泛种植，并成为当地农民收入的重要来源。目前，新疆南疆四地州已成为世界上最大的红枣生产基地。然而，随着枣树种植面积的增加，栽培模式的多样化以及新品种的不断引进造就了不同类型的新疆枣园生态小气候，一些次要病害逐渐上升为主要病害，一些新病害也相继出现，诸如由Alternariaalternata引起的枣叶斑病和枣褐色斑点病[2-3]，以及由Nothophomaquercina引起的枣褐斑病[4]等新病害。而枣软腐病曾是红枣生育后期危害红枣的次要病害，但近年来，该病发生呈逐年加重的趋势，且针对该病害的防治常常被枣农忽略，造成红枣品质下降和产量损失。 因此，明确枣软腐病的致病病原，在枣果生长期有针对性的开展病害防治，降低烂果率，对提高新疆红枣产量和品质，增加农民的收入具有重要的意义。【前人研究进展】目前，针对枣软腐病病原的说法不一，大部分研究者认为枣软腐病是一种由多病原复合侵染引进的烂果病，文献报道的致病病原主要有细极链格孢Alternariatenuissima(Fr.) Wiltshire、青霉菌PenicilliumcitrinumThom、根霉Rhizopusstolonifer(Ehrenb.ex Fr.) Vuill、层出镰刀菌Fusariumproliferatum(Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg、尖孢镰刀菌FusariumoxysporumSchlecht和短小芽孢杆菌BacilluspumilusMeyer and Gottheil等多种[5-8]，但大部分研究报道均缺少对病原的准确鉴定[9]，且这些病原菌在果实烘干加工前的存储期侵染能力更强，危害更加严重，并且随着存放时间的延长，烂果率随之增高[10-11]。近年来，研究发现枣软腐病在南疆红枣主产区均有不同程度发生，尤以阿克苏地区最为严重。该病在枣成熟期开始显症，当遇上雨水天气及采后储存期常与其它病原菌发生交叉感染现象，造成枣软腐病对南疆红枣的产量和品质产生重要的影响。【本研究切入点】由于该病在枣果成熟期发病，特别是在新疆高温、干燥的气候条件下症状不明显，常与枣果生理性皱缩病混淆，错过病害的防治适期，造成果实存储期病原菌交叉感染，烂果病发生加重。研究在前期实验调查的基础上，以阿克苏地区及周边红枣产区发生的枣软腐病为重点，在病害发生的潜伏期和发病期分别采集病害标本，准确鉴定病原。【拟解决的关键问题】研究枣软腐病在田间侵染过程中的潜伏期和发生期分别进行病原菌的分离、纯化和鉴定，减少交叉感染现象的发生，从而准确鉴定病原，为有针对性的开展病害防控和探索病害防控的关键点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

分别选取库尔勒地区若羌县米兰镇，阿克苏地区阿瓦提县的多浪乡红枣示范基地、新和县尤鲁都斯乡、温宿县佳木镇和阿克苏市一杆旗乡等红枣种植园作为样品的采集地点，并于每年7月中旬至8月下旬病害发生的潜伏期和9月病害发病期分别采集疑似软腐症状的果实样本(75份)作为病原鉴定材料。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离与纯化

每个取样地点选取10个枣软腐病症状的枣果标本(图1a-b)，用75% 的酒精消毒后切取病健交界处组织，置于PDA 平板培养基上，28℃培养3～5 d，分离到的疑似病原真菌采用单孢分离技术进行纯化。

1.2.2 病原菌的致病性实验验证

致病性实验于2016年8月在田间枣园进行，枣树树龄为7～8 a，采用伤口接种法将疑似病原物接种于健康枣果，不同来源的每种疑似病原菌选取3个代表单孢菌株，每个菌株接种50个健康果实，以接种无菌水为对照，并用0.4 mm 的塑料袋保湿48 h后，每天观察病害侵染情况，统计接种果实的发病率。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定

将通过致病性试验验证的病原在PDA 培养基上培养1周后，进行病原形态特征观察，测量分生孢子大小。采用玻片-水琼脂生长培养技术，进行病原菌生长性状及分生孢子着生方式观察，初步鉴定病原，鉴定标准参照文献的方法[12]。

1.2.4 病原菌的分子鉴定

选择不同县(市)共10个代表菌株作为分子鉴定材料，依据真菌 DNA 提取试剂盒操作说明提取各单孢菌株DNA，采用通用引物B9G[13]和ITS4[14]扩增ITS基因序列。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行回收。回收产物测序后，在GenBank进行blast 分析，利用MEGA5.0序列分析软件分别构建遗传进化树，进行病原菌的鉴定分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与纯化

在潜伏期样本中，疑似病原物主要是根霉菌(Rhizopussp.)和细菌(未鉴定)，分离频率分别为59%和6%，而在发病期样本中疑似病原物种类主要为根霉菌(Rhizopussp.)、链隔孢菌(Alternariasp.)和细菌(未鉴定)，分离频率分别为71%、17%和8%，其中发病期存在病原物交叉感染现象。

2.2 病原菌的致病性实验验证

研究表明，分离到的3种疑似病原物在接种5～7 d后开始陆续显症，其中根霉菌的显症最早，5 d 后接种伤口处出现黑色坏死斑点，后期病斑逐渐扩大，出现与枣软腐病相似的症状，发病率为67%(图1c)；接种链隔饱菌的枣果在接种7 d后，伤口处出现黑褐色坏死斑，后期逐渐愈合，发病率为26%，呈过敏性坏死症状，与枣软腐病症状不同；接种细菌的枣果，在7 d后亦出现坏死症状，后期愈合，发病率仅为7%。而在接种无菌水的健康枣果，未表现任何病害症状，发病率为0% (图1d)。基于致病性实验验证结果，枣软腐病的致病病原为根霉菌。图1

2.3 病原菌的形态学鉴定

针对致病性实验验证后的根霉菌的显微镜观察结果显示：在 PDA 培养基上培养 7 d 后，直径为441～469 mm，呈灰白色，后变成灰黑色，具假根。孢囊梗产生于菌丝上，形成匍匐丝，每束2～4 株，壁光滑，长达(205)450～2 000(2 500)μm ×(5)10～18 μm，顶部膨大形成囊轴和孢子囊；囊轴球形，淡褐色，直径(28)55～145(200)μm；孢囊梗束基部形成假根；孢囊孢子椭圆形，黄灰色，直径 6～11 μm。孢子囊形大小为(60)145～215(245)μm，初期白色，成熟后变黑色。真菌的形态学与根霉属中的米根霉的形态学特征一致，病原初步鉴定为米根霉Rhizopusoryzae(图1e)。

注：a: 田间自然侵染条件下枣果软腐病发病症状；b：发病枣果内部软腐症状；c田间人工接种后枣果的发病症状；d：接种无菌水的症状对照；e：枣软腐病病原菌在水琼脂上的生长培养症状

Note： (a) Natural infections on fruit of field-grown plants； (b)The symptoms of diseased fruit internal； (c) Chlorotic lesions on fruit surfaces 5-7 days after artificial inoculation； (d) Hypersensitive symptoms on fruit surfaces 5-7 days after artificial inoculation； (e) Characteristics of a colony ofRhizopusoryzaeon the upper surface of Water agar (WA).

图1 枣软腐病田间自然发病的果实受害症状及人工接种后的发病症状

Fig.1 Symptoms of fruit soft rot of jujube caused by natural infections and inoculations with Rhizopus oryzae in the field

2.4 病原菌的分子鉴定

PCR扩增片段回收测序后大小分别为622 bp(图2)，10单孢菌株各自的ITS基因片段彼此间的相似度为100%，1个代表菌株(XJRF 003)的ITS基因序列提交到基因库中，序列号为KY886224。遗传进化树分析结果表明：ITS序列片段 (GenBank accession no. KY886224)和基因库中已知的米根霉ITS序列聚类明显聚在一组，并且boot-strap 值为100%。依据形态学特征、致病性实验和分子鉴定结果，枣软腐病的病原被鉴定为R.orzage。图2，图3

图2 枣软腐病病原菌(Rhizopus oryzae)部分单孢rDNA-ITS扩增片段

Fig.2AgarosegelshowingrDNA-ITSfragmentsfrompartisolatesofRhizopusoryzae

图3 1个供试单孢与GenBank 中已报道的22个Rhizopus oryzae及相关单孢菌株ITS的遗传进化树

Fig.3 Phylogenetic tree constructed with nucleotide sequences of ITS of different Rhizopus oryzae isolates. including one new isolate of this study，and 22 isolates available in GeneBank

3 讨 论

研究针对枣软腐病在枣树生育期内病害发生潜伏期和显症期的病害样本进行了病原菌的分离鉴定，将病原鉴定为米根霉[R.oryzae]。而一些研究者在对新疆红枣存储期烂果病病原研究中，也发现该病菌是造成枣烂果病的主要病原菌之一[6-7]。由此说明，新疆发生的枣软腐病在枣树生长期间就已侵染部分枣果，而在采收后的存储期由于其它病菌的交叉感染，加剧了枣烂果病的发生。但研究中对枣软腐病的病原鉴定结果与内地报道的枣软腐病的致病病原种类不同。2011年王叶等[8]针对内地发生的枣软腐病的病原进行了分离鉴定，发现并证明层出镰刀菌Fusariumproliferatum(Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg和尖孢镰刀菌FusariumoxysporumSchlecht可引起枣田间软腐病。而研究中的病害样本仅限于南疆部分县(市)的5个采集地，至于整个南疆地区枣软腐病病原种类及其致病优势种群如何，是否存在其它病原种类的可能，还需要进一步的扩大采集区域分区分类进行鉴定，并针对特定病原靶标开展有效的防控技术研究，为新疆红枣产业的转型升级和提质增效目标任务的完成提供理论依据。

4 结 论

研究针对采自南疆地区 5 个县(市)的枣软腐病潜伏期的75份枣果实标本，经组织分离和纯化得到根霉菌(Rhizopussp.)、链隔孢菌(Alternariasp.) 和细菌3种疑似病原物，分离频率分别为71%、17%和8%。致病性实验结果显示：接种根霉菌的健康枣果5 d 后在接种伤口处出现黑色坏死斑点，后期病斑逐渐扩大，出现与枣软腐病相似的症状，发病率为67%。接种链隔饱菌和细菌的健康枣果尽管在初期也具有一定的致病力，发病率分别为26%和7%，但发病症状与枣软腐病症状明显不同，且在后期伤口愈合，呈过敏性坏死症状。因此，基于致病性实验验证结果，枣软腐病的致病病原为根霉菌。通过形态学鉴定和病原菌ITS序列分析，进一步明确了枣软腐病致病病原为米根霉。因此，基于形态学鉴定、致病性实验和分子鉴定结果，南疆地区枣软腐病致病病原被鉴定为米根霉(R.oryzae)。

References)

[1] 刘孟军, 汪民.中国枣种质资源[M].北京: 中国林业出版社, 2009: 56-57.

LIU Meng-jun, WANG Min. (2009).ChineseJujubeGermplasmResources[M]. Beijing: China Forestry Press: 56-57. (in Chinese)

[2] Bai, J. Y., Guo, Q. Y., Wang, X. M., & Duan, C. X. (2015). First report of jujube leaf spot caused by alternaria alternata in China.PlantDisease, 99(11): 1,624.

[3] Bai, J. Y., Wang, X., Shi, Y., & Duan, C. (2016). Occurrence and identification of nothophoma quercina causing brown spot of jujube in China.CanadianJournalofPlantPathology, 38(4): 527-532.

[4] Bai, J. Y., Guo, Q. Y., Song, F. J., Liu, Z. X., Liu, Y., & Lei, C. J. (2015). First report ofAlternariaalternatecausing brown spot of zizyphus jujuba in China.JournalofPlantPathology, 97(2): 55-57.

[5] 雷春军，黄晓玲，刘正兴，等.阿克苏地区骏枣储藏期致腐病原菌种类鉴定[J].新疆农业科技，2014，(4):16-17.

LEI Chun-jun, HUANG Xiao-ling, LIU Zheng-xing, et al.(2014). Identification of pathogens species of jun jujube in storage period of fruits in Aksu, Xinjiang [J].XinjiangAgriculturalScienceandTechnology, (4):16-17. (in Chinese)

[6] 沙娜瓦尔·色买提，玉山江·买买提，郭庆元，等. 枣果霉烂病病原鉴定(一)：引起新疆枣果霉烂病的几种曲霉菌的分离鉴定[J].新疆农业科学，2016,53(3):502-509.

Shanawaer Semaiti, Yushanjiang Maimaiti, GUO Qing-yuan, et al. (2016). Identification of the pathogen causing jujube fruit mildew (Part I): Isolation and identification of Aspergillus fungus causing jujube fruit mildew [J].XinjiangAgriculturalSciences, 53(3):502-509. (in Chinese)

[7] 沙 娜 瓦 尔·色 买 提，玉 山 江·买 买 提，郭 庆 元，白 剑 宇. 枣果霉烂病病原鉴定(一)：引起新疆枣果霉烂病的几种青霉菌的分离鉴定[J].新疆农业科学，2016,53(4):698-705.

Shanawaer Semaiti, Yushanjiang Maimaiti, GUO Qing-yuan, et al. (2016). Identification of the pathogen causing jujube fruit mildew (Part II): Isolation and identification ofPenicilliumfungus causing jujube fruit mildew [J].XinjiangAgriculturalSciences, 53(4):698-705. (in Chinese)

[8] 王叶.枣果实病原真菌的鉴定及链格孢属病原真菌多样性研究[D].郑州：河南农业大学硕士论文，2011.

WANG Ye.(2011).TheidentificationofpathogenfungicausingjujubefruitdiseasesanddiversityofAlternariapathogens[D]. Master Thesis. Henan Agricultural University, Zhengzhou. (in Chinese)

[9] 张晓申.枣烂果病种类及防治措施 [J].北京农业，2008，(9) :31.

ZHANG Xiao-shen. (2008). Species and control measures of jujube fruit rot [J].BeijingAgriculture, (9): 31. (in Chinese)

[10] 王学军，俎文芳，王广鹏. 枣烂果病的发生原因及防治措施[J].河北果树，2002,(5)：52-53.

WANG Xue-jun, ZU Wen-fang, WANG Guang-peng. (2002).The occurrence reason and control measures of jujube fruit rot [J].HebeiFruitTree, (5):52-53. (in Chinese)

[11] 柴全喜, 宋素智. 综防冬枣贮存期病害[N].河北科技报，2013，10(15)：B06.

CHAI Quan-xi, SONG Su-zhi. (2013).The integrated control of winter jujube in storage period of fruits [N].HebeiScienceandTechnologyNewspaper, 10(15)：B06. (in Chinese)

[12] 魏景超.中国真菌志:根霉属[M]. 北京: 科学出版社, 1979: 62- 66.

WEI Jing-chao. (1979).ChineseJournaloffungi:Alternaria[M]. Beijing: Science Press: 62-66. (in Chinese)

[13] White, T. J., Bruns, T. D., Lee, S. B., Taylor, J. W., Innis, M. A., & Gelfand, D. H., et al. (1990).AmplificationandDirectSequencingofFungalRibosomalRNAGenesforPhylogenetics. PCR Protocols.

[14] de Hoog, G. S., & Ah, G. V. D. E. (1998). Molecular diagnostics of clinical strains of filamentous basidiomycetes.Mycoses, 41(5-6): 183-189.

IdentificationofthePathogenofJujubeSoftRotinXinjiang

BAI Jian-yu1,2，SONG Feng-hui2，WU Zheng-bao2，LIU Zheng-xing3， CUI Yan-hua3，SHI Yan-jiang2

(1.PostdoctoralMobileResearchStationofCollegeofForestryandHorticulture，Urumqi830052，China; 2.ResearchInstituteofEconomicForestry，XinjiangAcademyofForestrySciences，Urumqi830063，China; 3.AgriculturalTechnologyExtensionCenterofAksuPrefecture,AksuXinjiang843000,China)

【Objective】 The pathogen of soft rot disease of jujube was accurately identified so as to lay a foundation for disease prevention and control. 【Method】The suspected pathogens were obtained by the conventional isolation technology and were preliminarily identified by morphological features and loop validation. The fragments of ITS gene of the suspected pathogens were obtained by the PCR technique. When the related trains ofRhizopusoryzaein GenBank were compared and analyzed, the genetic evolutionary tree was constructed and the pathogen was identified by morphological identification and pathogenicity experiments.【Result】According to the morphological characteristics and the pathogenicity test results, the morphological characteristics of Rhizopus soft rot pathogen of Xinjiang jujube were similar to that ofRhizopusoryzae. The phylogenetic analysis of the pathogen showed that the ITS gene of pathogen of jujube soft rot showed 99 % to 100 % similarity with part ITS gene ofRhizopusoryzaein GenBank, and in the analysis of phylogenetic tree, they were clustered in the same group.【Conclusion】Based on the morphological characteristics, pathogenicity test and molecular identification of the pathogen, the pathogen of jujube soft rot was identified asRhizopusoryzae.

jujube soft rot; rDNA-ITS; pathogens identification; phylogenetic analysis

SHI Yan-jiang, (1961- ), male, native place: Shanxi. Professor, research field: Introduction and breeding of forest trees, (E-mail) syj504@126. Com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.013

2017-06-09

中国博士后科学基金面上项目“新疆红枣黑斑病菌的田间追踪检测技术研究”(2014M552565XD)；新疆维吾尔自治区林业发展补助资金项目“南疆红枣主产区红枣主要病害普查鉴定及田间追踪监测技术研究”(XJLKY2016056)

白剑宇(1977-)，男，河北承德人，副研究员，博士后，研究方向为林业有害生物防控，(E-mail)bjyhao2010@sina.com

史彦江(1961-)，男，山西人，研究员，研究方向为林木引种育种，(E-mail)syj504@126.com

S436.64

：A

：1001-4330(2017)08-1475-06

Supported by: China Postdoctoral Science Foundation Project "The Tracking and Detection Technology of Pathogen of the Black Spot of Jujube in Fields in Xinjiang" (2014M552565XD) and Xinjiang Uygur Autonomous Region Research Institute Fund Project "Study on the Monitoring Technology of Screening and Identification of Main Diseases and Field Tracking in the Main Jujube Producing Areas in Southern Xinjiang" (KYGY2016055)