姜辣素滴丸的制备及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用*

王 蕾 袁圣楠 李 丽 齐思佳 刘倩倩 张志远

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

姜辣素滴丸的制备及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用*

王 蕾 袁圣楠 李 丽 齐思佳 刘倩倩 张志远

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

目的 制备姜辣素滴丸并探讨其对酒精性肝损伤的保护作用。方法 采用正交设计法，观察姜辣素滴丸的基质选择、药液温度、基质配比三因素对滴丸硬度、圆整度、拖尾情况、溶散时间的影响，进行处方筛选。另取40只清洁级昆明小鼠，随机分为4组：正常组、模型组、姜辣素滴丸给药组(400 mg·kg-1·d-1)、阳性药物联苯双酯对照组(150 mg·kg-1·d-1)。以白酒灌胃法(0.15 ml/10 g)建立酒精性肝损伤模型，正常组给予等量生理盐水处理；灌胃2 h后给予相应药物处理，实验3周后检测各实验组血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量变化，同时观察肝脏形态学改变。结果 姜辣素滴丸外观完整，溶散时间短，给药后可明显降低小鼠血清中ALT、AST的活性，提高肝匀浆中SOD活性，降低MDA含量，改善肝脏病理学变化。结论 姜辣素滴丸处方合理，制备简单，对长期饮酒造成的酒精性肝损伤有一定的保护作用，其机制可能与抗氧化作用有关。

姜辣素滴丸；制备；酒精性肝损伤；抗氧化

姜通称生姜，属多年生草本植物，其根茎肥厚，具有芳香味和辣味，是传统的药食两用植物。在中医理论中，生姜性味辛、温，归肺脾胃经。用于发汗解表，温中止吐，温肺止咳，风寒感冒。姜辣素是姜生物活性的主要成分，在调味品、保健食品、药品、化妆品等行业应用广泛[1]。现代医学证实，它具有多种生理和药理作用：抗氧化、抑菌、清除自由基、降低胆固醇、抗肿瘤、抗炎、保肝利胆、抗运动病、降血糖、抗血小板凝集等[2-4]。但姜辣素因较粘稠，化学和热不稳定性，使其生物利用度较低，临床应用受到限制。

滴丸是指固体或液体药物与适当物质(一般称为基质)加热熔化混匀后，滴入不相混溶的冷凝液中、收缩冷凝而制成的小丸状制剂，主要供口服使用。具有制备简单、质量可控，生物利用度高等优点[5-6]。因此考虑采用聚乙二醇作为基质，将姜辣素做成滴丸，以提高生物利用度。本试验前期内容主要是采用正交设计法，处方筛选，将姜辣素做成滴丸。

随着人们生活水平的不断提高，酒精消费人群逐年增加，因长期大量饮酒引起的酒精性肝损伤(alcoholic liver damage, ALD)也与日俱增[7-8]。目前临床治疗酒精性肝损伤除采用戒酒，营养支持治疗外，化学药物治疗也是其重要的治疗手段。常采用联苯双酯、水飞蓟素、美他多辛来治疗酒精性肝损伤，这些药物除了对人体自身有副作用外，对于晚期患者的治疗效果也不尽如意[9]。因此，开发安全有效的预防酒精性肝损伤的药物具有十分重要的意义。本试验后期内容主要是制备酒精性肝损伤模型，初步评价姜辣素滴丸对酒精性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1动物 健康清洁KM小鼠 (18～20 g)，由泰山医学院实验动物中心提供。

1.2药品和试剂 姜辣素，购于成都瑞芬思生物科技有限公司；联苯双酯，购于仁济大药房；谷丙转氨酶 (ALT) 试剂盒、谷草转氨酶 (AST) 试剂盒，超氧化物歧化酶 (SOD) 试剂盒，丙二醛 (MDA) 试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.3仪器 BP211D型分析天平，美国Sar-torius公司产品；TGL20M低温离心机，盐城凯特实验仪器有限公司；Bio-rad680酶标仪；自制简易滴丸装置。

1.4方法

1.4.1姜辣素滴丸的制备工艺与处方筛选 根据相关资料及文献，选择聚乙二醇4000和聚乙二醇6000为基质，以正交试验优选姜辣素滴丸的基质配比、药液温度以及药物与基质的配比选用选择L9(33) 进行实验。见表1。

表1 正交实验水平表

用胶头滴管吸取适量上述除尽气泡的姜辣素-PEG混匀熔融液，滴口距离冷却液5 cm，控制滴速为40滴/min，均匀滴入80 cm长的液体石蜡冷凝液中，观察滴丸的成型状况及沉降时间，待冷凝完全，倾去冷凝液，沥静，收集滴丸。

1.4.2酒精性肝损伤模型的建立 取40只清洁级小鼠 (18～20 g，雌雄各半)，随机分为4组：正常组、模型组、姜辣素滴丸给药组、阳性对照组。正常组每日给予生理盐水灌胃；其余3组用二锅头白酒灌胃，剂量为0.15 ml/10 g。白酒灌胃后，正常组及模型组不做给药处理，其余两组在灌酒2 h后分别给予姜辣素滴丸 (400 mg·kg-1·d-1) 和联苯双酯溶液(150 mg·kg-1·d-1)，每天1次，持续3周。

1.4.3生化指标检测 实验3周后，小鼠末次灌胃禁食12 h后，摘眼球取血，颈部脱臼处死，快速取出肝脏组织。一部分甲醛固定，待做病理学检测；另一部分用冰生理盐水制成10%的肝匀浆。检测各实验组肝匀浆中SOD、MDA及血清中ALT、AST的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.4HE染色，观察肝脏病理形态学变化 快速取出肝脏组织后，4%多聚甲醛固定24 h、自来水冲洗24 h、后浸泡于75%乙醇中保存，待做病理形态学观察时，常规脱水，石蜡包埋，HE染色。观察各实验组肝组织形态的变化。

1.4.5数据统计处理 采用SPSS18.0软件进行统计分析，实验数据均用均数±标准差表示，各组之间比较采用方差分析，以P≤0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1正交实验结果 以滴丸硬度、圆整度、拖尾情况、溶散时间为考察指标。硬度由硬至软分为1～5级，外形由圆整至不圆整分为1～5级，拖尾情况由好至差分为1～5级，记录溶散时间。以硬度、圆整度、拖尾的评级和溶散时间作为评分标准，即K=硬度评级+圆整度评级+拖尾评级+溶散时间，以K值越小越好。结果见表2。由正交实验结果可知最佳滴制条件为A1B3C3，即基质聚乙二醇4000∶聚乙二醇6000=1∶1，姜辣素∶基质=1∶6，药液温度为70℃时，是制备姜辣素滴丸的最佳条件。方差分析结果表明，因素C对试验结果有显著影响，即药物与基质的配比影响最大，而基质配比和药液的温度无显著性差异。采用最佳滴制条件 A1B3C3，制取充足的姜辣素滴丸，并根据中国药典的标准筛取符合条件的滴丸，以便进行下一步实验。

2.2姜辣素滴丸对小鼠血清ALT、AST酶活性的影响 与对照组相比，模型组中ALT、AST活性明显增高 (P<0.01)，提示酒精性肝损伤模型成功；与模型组相比，两个给药组小鼠血清中ALT、AST活性均降低 (P<0.01)，姜辣素滴丸给药组降低的更为明显，见表3。

表2 正交实验与结果

表3 各实验组小鼠血清ALT和AST酶活力的比较

注：与正常组相比▲P<0.01；与模型组相比★P<0.01。

2.3姜辣素滴丸对小鼠肝匀浆SOD、MDA含量的影响 与对照组相比，模型组中SOD活性明显降低，MDA含量增高 (P<0.01)；与模型组相比，两个给药组均可升高SOD活性(P<0.01)，同时降低MDA含量(P<0.05)，姜辣素滴丸给药组作用最为明显。见表4。

表4 各实验组小鼠肝匀浆中SOD、MDA水平的影响

注：与正常组相比▲P<0.01；与模型组相比★P<0.01，#P<0.05。

2.4肝脏病理形态学变化 各实验组小鼠肝脏病理学的变化见图1。与对照组相比，模型组小鼠肝索紊乱，肝小叶融合，出现大量片状肝细胞空泡样变，细胞浆内含有少量大小不一的脂肪空泡，中央静脉周围可见大量炎细胞浸润，姜辣素滴丸给药组和阳性对照组小鼠肝脏多见索条状排列的肝细胞，肝小叶较多的保存完整，炎症细胞浸润明显减轻。

正常对照组 (HE, 100×)

模型组 (HE, 100×)

姜辣素滴丸给药组 (HE, 100×)

3 讨 论

本研究采用正交设计法设计探讨了姜辣素滴丸的最佳成型条件，最终确定聚乙二醇4000∶聚乙二醇6000=1∶1，姜辣素∶基质=1∶6，药液温度为70℃时，得到的滴丸外形质量好，溶散时间短，质量无显著性差异，此制备方法简单合理，稳定可行。姜辣素滴丸的制备克服了药物本身溶解性差，生物利用度低的缺点，滴丸剂中药物分散在基质中，可有效改善难溶性药物在体内的溶解和吸收，具有速效，提高生物利用速度的特点。

人类饮酒之风盛行已久，适当的饮酒对身体有一定的健康效应，但长期过量饮酒严重危害着人们的身体健康。酒精性肝损伤是其最主要的表现之一。初期表现为脂肪肝，进而酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化，严重者可发展为肝癌。所以有关预防和治疗酒精性肝损伤的课题引起了广泛的关注，但有关姜辣素滴丸对酒精性肝损伤的保护作用还未见报道，具体机制也尚不明确。本课题采用连续灌酒的方式成功建立小鼠酒精性肝损伤模型，观察姜辣素滴丸对其干预作用并初步探讨作用机制。

肝脏因机体摄入大量酒精受损时，会导致线粒体功能的变化或丧失，使存在于细胞浆和线粒体中的ALT、AST释放到血清中。临床上常通过测定ALT、AST的活力来作为肝细胞损伤的特异性指标。在本实验中，连续灌酒3周后，模型组小鼠血清中ALT、AST活性水平明显升高，同时呈现出肝脏病理学的变化，证实小鼠酒精性肝损伤模型建立成功。从氧化应激和抗氧化指标分析，观察到模型组小鼠肝匀浆中脂质过氧化产物MDA含量增加，SOD活性下降，此变化结果与文献报道一致[10]。我们知道，SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物质，防止脂质过氧化反应。MDA作为机体脂质过氧化反应的最终产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，具有细胞毒性，其含量可以反映组织中自由基的含量和组织细胞受到自由基攻击即脂质过氧化反应的程度。本研究造模的同时使用姜辣素滴丸和联苯双酯药物进行干预，实验3周后结果显示，小鼠血清中ALT、AST水平均下降，SOD活力增加，MDA含量降低，同时肝细胞脂肪空泡减少，肝小叶保存完整，炎症改善。以上表明药物干预后对小鼠酒精性肝损伤有一定的保护作用，对肝脏早期出现的病理形态学变化有一定的抑制发展甚至逆转作用，相比之下，姜辣素滴丸比阳性药物的干预作用更强。其作用机理与清除体内自由基，抑制脂质过氧化反应有关。

总之，本研究证实姜辣素滴丸对酒精代谢引起的小鼠体内氧化和抗氧化的平衡失调有一定的保护作用，可降低小鼠血清中ALT、AST活性，清除自由基，改善肝脏病理学变化。其机制与姜辣素滴丸的抗氧化活性有关，提高抗氧化酶SOD活性，抑制过氧化作用，从而减轻酒精对小鼠肝脏的损害。但由于时间原因，本研究中姜辣素滴丸没有设置不同剂量进行比较，所以有关最佳剂量和更深入的作用机理有待进一步研究。

[1] 蒋苏贞,宓穗卿,王宁生. 姜辣素的化学成分研究概述[J]. 中药新药与临床药理，2006,17(5):386-389．

[2] Surh YJ. Anti-lumor promoting potential of selected spice ingredients with anti-oxidative and anti-inflammatory activities: a short review[J]. Food and Chemical Toxicology, 2002,40(8):1091-1097.

[3] Bode AM, Ma WY, Sur YJ, et al. Inhibition of epidermal growth factor induced cell transformation and activator protein activation by 6-gingerol[J]. Cancer Research, 2001,61(3):850-853.

[4] Huang Xue-song, Yan Ri-an, Wu Jian-zhong. Bioactivation of gingerol from ginger (Zingiber officinale Roscoe) [J]. Journal of Jinan University, 2005,26(3):434.

[5] 洪怡,何伟,曹艳,等. 姜黄素滴丸的制备[J]. 临床合理用药, 2013,1(6):43-44．

[6] 宋凤兰,潘育方,侯冬枝,等. 葛根总黄酮滴丸的制备与溶出度研究[J]. 中草药, 2014,9(45):1252-1256．

[7] Lefkowitch JH. Morphology of alcoholic liver disease [J]. Clinic in Liver Disease, 2005, 9(1): 37-53.

[8] Crabb DW, Liangpunsakul S. Alcohol and lipid metabolism [J]. J Gastroenterology and Hepatology, 2006, 21(3): 56-60.

[9] 白冰,何清,唐尉,等. S-腺苷蛋氨酸治疗酒精性肝病的系统评价[J]. 中国肝脏病杂志:电子版, 2012,4(2): 1-9.

[10] 吴伟青,陈静,刘超群,等. 绿茶多酚对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2011, 13(32): 310-313.

Protective effect of gingerol dropping pills against alcoholic liver injury in mice

WANG Lei YUAN Sheng-nan LI Li QI Si-jia LIU Qian-qian ZHANG Zhi-yuan

(Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective:To study the protective effect of gingerol dropping pills against alcoholic liver injury in mice. Methods: The prescription was selected by orthogonal design method and the effect of the option and ratio of ground substance, the temperature of drug. The hardness, circular degree，the tail formation and the dissolution time were studied. Totally 40 KM mice were randomly divided into control group, model group, gingerol dropping pill group (400 mg·kg-1·d-1) and positive control group (bifendate, 150 mg·kg-1·d-1) of 10 mice each. The mice from the model and two drug groups were administrated with liqueur (0.15 ml·g-1·d-1) daily by gavage for 3 weeks, Two hours later, drug group mice were treated corresponding gingerol dropping pill and bifendate. Meanwhile, the control group were gavaged same amount of normal saline. Finally, when the model of acute alcoholic liver injury was established on the 22st day, Biochemical indicators of ocular blood in mice were observed. We also observed the change of liver morphology. Results: Under optimum conditions, we can obtain dropping pills having circular shape, touching with hardness and short dissolution time. The levels of alanine transaminase (ALT), glutamic-oxaloacetic transaminase (AST) and malondialdehyde (MDA) in drug groups were obviously decreased, While the activity of Superoxide dismutase (SOD) were increased. In addition, compared with the model group, drug groups attenuated or even reversed hepatic pathological changes. Conclusion: The prescription of gingerol dropping pills was reasonable, and the preparation process was simple. Gingerol dropping pills can protect liver from alcoholic liver injury to some extend, and the mechanism may be related to its antioxidant effect.

gingerol dropping pills; preparation; alcoholic liver injury; antioxidation.

泰安市大学生科技创新计划项目(2015D064)；国家级大学生创新创业计划项目(201510439078)；泰安市科技发展计划项目(2015NS2104)。

王蕾 ，女，硕士，助理实验师。

R961

：A

：1004-7115(2017)09-0996-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.09.012

2017-06-03)