靶向干扰ARTN对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖能力的影响*

王晓华，张玉娟，周晓慧，徐 倩

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

靶向干扰ARTN对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖能力的影响*

王晓华1，张玉娟2△，周晓慧1，徐 倩1

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

目的:通过RNA干扰技术靶向抑制ARTN基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达，探讨抑制ARTN基因对Ishikawa细胞增殖能力的影响。方法：体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞，以pGPU6/GFP/Neo为载体构建ARTN基因的短发夹RNA（pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA）干扰质粒，利用脂质体法转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞，荧光显微镜下观察转染效率，应用Western Blot法检测转染后细胞ARTN蛋白的表达情况，CCK法检测Ishikawa细胞的增殖活性。结果：pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干扰质粒成功转染Ishikawa细胞，转染效率为80%；转染后48h，干扰组Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和正常组（P＜0.05）；转染后48h、72h、96h，干扰组Ishikawa细胞的增殖活性明显低于阴性对照组和正常组（P＜0.05）。结论：靶向干扰ARTN基因可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力。

ARTN基因是胶质细胞源性神经营养因子家族的一员，对神经系统的生长及发育具有支持、营养的功能[1]。近年研究发现，ARTN基因不仅参与神经损伤后的修复过程[2-3]，并且对多种肿瘤的发生发展起到一定的调控作用。但ARTN基因对不同肿瘤细胞增殖作用的影响不同，对乳腺癌[4]、非小细胞肺癌[5]、食管癌[6]细胞的增殖有明显促进作用，而对胰腺癌[7]细胞的增殖无明显影响。本研究应用RNA干扰技术抑制ARTN基因在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达，探讨ARTN基因对Ishikawa细胞增殖作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 子宫内膜癌Ishikawa细胞（南京凯基生物科技发展有限公司）；胎牛血清（FBS）、PRMI 1640培养基（美国Gibco公司）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；兔抗人ARTN单克隆抗体（英国艾博抗贸易有限公司）；鼠抗人β-actin多克隆抗体（美国Affinity Biosciences公司）；CCK试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；pGPU6/ GFP/Neo-ARTN shRNA（苏州吉玛基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：Ishikawa细胞用含10% FBS的PRMI 1640培养基培养，细胞覆盖率达80%时传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞转染：转染前24h将细胞接种于6孔板，密度为4×105个/ml，转染时细胞丰度为70%-90%。按Lipofectamine 2000说明书进行转染试剂的配制。实验分为pshRNA-A干扰组（转染pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA干扰质粒），pshRNA-NC阴性对照组（转染pGPU6/GFP/Neo空载体质粒）和正常组（正常血清培养，未转染质粒）。转染6h后弃去原培养基，更换为含10% FBS的完全培养基继续培养。转染24h后荧光显微镜下观察并计算转染效率。

1.2.3 Western Blot法检测Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达情况：转染后48h，提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量后，进行凝胶电泳。12%分离胶和5%浓缩胶分离蛋白并电转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗（ARTN 1：1000）4℃孵育过夜，二抗（1：3000）孵育1h，ECL超敏化学发光液显影。应用Quantity-one 4.6.2图像分析软件行光密度分析，用目的蛋白与内参蛋白β-actin的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.4 CCK法检测细胞增殖能力：收集转染后各组细胞，调整细胞密度至4×104/ml，均匀接种至96孔板，每组设6个复孔，同时设置调零孔。分别于转染后24h、48h、72h、96h加入CCK原液10μl，37℃、5% CO2培养箱孵育2.5h，酶标仪测定450nm处吸光度值（OD值），取OD平均值并绘制细胞生长曲线。

1.3 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率 转染24h后荧光显微镜下可见细胞内强弱不等的绿色荧光，计算得出转染效率为80%[转染效率（%）=暗视野绿色荧光细胞数/明视野细胞数]。见图1：

图1 Ishikawa细胞转染情况（荧光显微镜，×200）（A.明视野，B.暗视野）

2.2 Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达情况 转染ARTN干扰质粒后48h，pshRNA-A干扰组、pshRNA-NC阴性对照组和正常组ARTN蛋白的相对表达量分别为0.346±0.021、1.053±0.024、1.080±0.034，pshRNA-A干扰组ARTN蛋白的表达明显低于其它两组（P＜0.05）。

2.3 CCK法检测细胞增殖能力 转染ARTN干扰质粒后24h，各组Ishikawa细胞增殖活性比较，差异无统计学意义（P＜0.05）；转染ARTN干扰质粒后48h、72h、96h，pshRNA-A干扰组细胞的增殖活性明显低于阴性对照组和正常组（P＜0.05）。见附表、图2：

附表 各组Ishikawa细胞的增殖情况（±s，n=6）

附表 各组Ishikawa细胞的增殖情况（±s，n=6）

与阴性对照组、正常组比较：*P＜0.05

组别 24h 48h 72h 96h pshRNA-A干扰组 0.169±0.036 0.348±0.044*0.589±0.104*1.044±0.039*pshRNA-NC阴性对照组 0.178±0.035 0.545±0.055 0.923±0.153 1.182±0.087正常组 0.179±0.039 0.558±0.035 0.956±0.128 1.192±0.042

图2 各组Ishikawa细胞的生长曲线

3 讨论

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势。肿瘤发生原因大多是由于机体在基因水平上失去了对细胞生长的正常调控，导致细胞异常克隆性增殖，并伴有不同程度的分化异常。近些年的研究发现[8]，ARTN基因在人类多种恶性肿瘤中高表达，并参与调控肿瘤细胞的增殖能力，而ARTN对子宫内膜癌影响的研究报道很少。

本研究利用ARTN干扰质粒转染Ishikawa细胞，荧光显微镜下观察计算转染效率为80%，转染效果可靠。转染后48h Western Blot法检测显示干扰质粒可明显抑制Ishikawa细胞ARTN蛋白的表达。CCK法发现，转染24h各组细胞增殖水平无明显差异，可能转染干扰质粒的时间较短，尚未能发挥干扰作用；随着转染时间的延长，转染后48h、72h、96h，干扰组细胞的增殖水平明显低于阴性对照和正常组。本研究提示干扰ARTN基因可显著抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖能力。

虽然目前对ARTN基因的研究尚处于起步阶段，但随着对其研究的不断深入，ATRN基因可能为恶性肿瘤的病因研究及治疗提供新的研究方向。

[1]Baloh RH, Tansey MG, Lampe PA, et al. Artemin, a novel member of the GDNF ligand family, supports peripheral and central neurons and signals through the GFRalpha3-RET receptor complex[J]. Neuron, 1998, 21(6): 1291-1302.

[2]Martin-Caraballo M, Dryer SE. Glial cell line-derived neurotrophic factor and target-dependent regulation of large-conductance KCa channels in developing chick lumbar motoneurons[J]. J Neurosci, 2002, 22(23): 10201-10208.

[3]Keast JR, Forrest SL, Osborne PB. Sciatic nerve injury in adult rats causes distinct changes in the central projections of sensory neurons expressing different glial cell line-derived neurotrophic factor family receptors[J]. J Comp Neurol, 2010, 518(15): 3024-3045.

[4]Kang J, Perry JK, Pandey V, et al. Artemin is oncogenic for human mammary carcinoma cells[J]. Oncogene, 2009, 28(19): 2034-2045.

[5]Tang JZ, Kong XJ, Kang J, et al. Artemin-stimulated progression of human non-small cell lung carcinoma is mediated by BCL2[J]. Mol Cancer Ther, 2010, 9(6): 1697-1708.

[6]李书军，和宇峥，王有富，等.Artemin和基质金属蛋白酶2在食管鳞癌中的表达及其临床意义[J].广东医学，2010，31(19)：2567-2569.

[7]古赛，黄妙兴.Artemin对体外胰腺癌细胞增殖与侵袭影响的实验研究[J].重庆医科大学学报，2010，35(12)：1814-1816.

[8]Yoshida N, Kobayashi K, Yu L, et al. Inhibition of TRPA1 channel activity in sensory neurons by the glial cell line-derived neurotrophic factor family member, artemin[J]. Mol Pain, 2011,7：41.

(基础医学栏目编辑：陈志宏)

EFFECTS OF TARGETED INTERFERENCE OF ARTN ON PROLIFERATION OF ENDOMETRIAL CANCER ISHIKAWA CELLS

WANG Xiao-hua, ZHANG Yu-juan, ZHOU Xiao-hui, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of inhibiting ARTN gene by targeted interference of ARTN gene on proliferation of endometrial cancer Ishikawa cells.Methods:Short hairpin RNA (pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA) interference plasmid of ARTN gene was constructed using pGPU6/GFP/Neo as carrier, and transfected into human endometrial cancer Ishikawa cells by liposome method. The transfection eff i ciency was observe under fl uorescence microscope; Western Blot was used to detected ARTN protein expression in Ishikawa cells after transfection; CCK method to detect the proliferative activity of Ishikawa cells.Results:The pGPU6/GFP/Neo-ARTN shRNA interference plasmid was successfully transfected into Ishikawa cells and the transfection eff i ciency was 80%. 48h after transfection, the ARTN protein expression of Ishikawa cells in interference group was obviously lower than negative control group and normal group (P＜0.05). 48h, 72h and 96h after transfection, the proliferative activity of Ishikawa cells in interference group was obviously lower than negative control group and normal group (P＜0.05).Conclusions:Targeted interference of ARTN gene can inhibit the proliferative activity of endometrial cancer Ishikawa cells.

Endometrial cancer; ARTN gene; RNA interference; Proliferation

R737.33

A

1004-6879（2017）05-0368-03

2016-12-03）

* 河北省科技厅科技支撑项目（14277766D）

△ 通讯作者

【关键词】 子宫内膜癌；ARTN基因；RNA干扰；增殖