昆明市西山区山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定

郑国英，马玉馨，李太仙 ，尹海英，邵庆勇，信爱国， 高华峰*，李志明*

(1.昆明市西山区农林局，云南昆明 650100；2.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650024； 3. 云南农业大学，云南昆明 650201； 4. 昆明市西山区海口街道办事处，云南昆明 650114)

昆明市西山区山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定

郑国英1，马玉馨2,3，李太仙4，尹海英1，邵庆勇2，信爱国2， 高华峰2*，李志明1*

(1.昆明市西山区农林局，云南昆明 650100；2.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650024； 3. 云南农业大学，云南昆明 650201； 4. 昆明市西山区海口街道办事处，云南昆明 650114)

羊伪结核病是山羊一种慢性消耗性细菌病，对山羊养殖业的危害极大。为控制本病的发生，从2016年期间，对昆明市西山区存栏的38 225只山羊开展流行病学调查，结果表明伪结核病在西山区山羊平均发病率为10.3%，病死率0.1%，采集病料经细菌分离鉴定、小鼠毒力试验、16 S rRNA序列分析比较及药敏试验，结果表明，引起本病的病原菌鉴定为山羊伪结核棒状杆菌，对其中2个菌株完成了生化鉴定及药敏试验分析。生化及16 S序列分析结果表明，分离菌株为羊伪结核棒状杆菌，对完成系统鉴定的2株细菌完成药敏试验，结果表明，除链霉素、甲硝唑及复方新诺明外的大多数抗菌药物均对其敏感，可为该地区及昆明其他疫区临床用药提供参考。

羊伪结核病；流行病学；分离鉴定；药敏试验

2005年以来在昆明西山区发现在养殖山羊中出现一种潜在的、造成经济损失很大的消耗性疾病，其表现是羊体内外生长脓疱，此后逐年递增，初步调查表明羊发病率为10.3%，病死率0.1%。该病主要通过动物与动物之间的接触传播，给西山区羊养殖业造成巨大损失。 初步研究表明，困扰养羊户多年的羊局部脓灶的主要病原为伪结核棒状杆菌引起的伪结核病，对山羊危害较大，也是一种人畜共患慢性传染病。本病是国际上公认的难以防控的传染病之一，侵入羊群则很难彻底清除，给养羊业的发展造成较大危害[1-2]。我们对昆明市西山区进行了系统的流行病学调查，并完成对分离菌株的生化及分子生物学鉴定，对分离菌株完成药敏试验，以期弄清本地区伪结核病流行规律，通过对分离菌株完成细菌16 S rRNA基因序列测定，比较本地区流行菌株16 S rRNA基因的变异情况，并在此基础上对部分典型菌株完成全基因组分析比较，并为将要开展的疫苗研究，病原及血清学诊断方法研究提供研究基础，在此基础上制定综合防控措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 羊伪结核病流行病学调查及病料采集 从昆明市西山区所有山羊养殖户进行入户调查，2016年期间，通过村防疫员及兽医站以问卷的形式对西山区621户养羊户羊存栏总数、伪结核病发病总数、死亡总数、历史发病情况及发病的治疗及处理情况各项指标逐一调查，对部分体表有脓包的成年山羊，在屠宰场调查其内脏组织病变情况。其余指标主要包括主要流行疫病包括口蹄疫、小反刍兽疫、传染性胸膜炎、三联四防疫苗及羊痘的免疫及本地区是否有其他不明原因山羊流行病的发生。

1.1.2 培养基与试剂 营养脂培养基、 血清肉汤培养基、2×TaqPCR Mix，天根生化科技有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，宝生物工程(大连)有限公司产品；小牛血清，昆明贝尔吉生物科技有限公司产品。

1.1.3 实验动物 38只昆明种小鼠，随机分成18组，其中一组为对照，每组2只，另设对照组1组，待小鼠适应3 d后进行注射细菌液体培养物，每只小鼠注射0.5 mL,对照组注射0.5 mL生理盐水。逐日观察小鼠发病及死亡情况。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离鉴定 将采集的18份脓汁无菌操作接种于血清琼脂平板，37℃培养18 h～24 h后进行菌落观察,并涂片、革兰染色、镜检。根据菌落形态、菌体形态和染色特性初步判定细菌种属，而后将典型菌落接种培养基二次纯化培养，18 h～24 h后镜检观察,细菌单克隆液体纯培养物接种于营养肉汤,进行增殖培养,以进行生化鉴定。

1.2.2 样品DNA提取 细菌基因组DNA提取，参照说明书提取后置-20℃保存。

1.2.3 细菌16 S rRNA基因的扩增、测序及分析 以细菌基因组提取试剂盒分别提取分离菌的基因组DNA,以16 S rDNA通用引物(F27 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;F1492 5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) 片段长度 1 465 bp[3-4]。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用上述引物对提取的基因组DNA同时进行PCR扩增，反应体系(25 μL)为：PremixTaq12.5 μL,上下游引物分别为0.5 μL, 模板DNA(20 ng/μL),灭菌蒸馏水补至25 μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；50℃ 40 s,72℃ 90 s，共30个循环；72℃ 10 min。反应结束后，用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR反应产物经胶回收试剂盒纯化后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，所得序列与GenBank中细菌16 S rRNA基因序列进行比较。

1.2.4 生化鉴定 取纯培养的单个菌落培养于血清培养皿内，按照API Coryne棒状杆菌试剂盒说明(购自法国梅里埃诊断产品有限公司)，取OD=6.0的细菌分别接种于硝酸钾、吡嗪酰胺、焦谷氨酸-β-萘胺、2-萘基-磷酸盐、萘酚-ASBI-葡萄糖醛酸、2-萘基-βD-吡喃(型)半乳糖苷、2-萘基-αD-吡喃(型)葡萄糖苷、1-萘基-N-乙酰基-βD-氨基葡糖苷、七叶灵/柠檬酸铁、尿素、明胶、阴性控制、D-葡萄糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露醇、D-丙二酸盐、D-乳糖(牛源) 、糖原、七叶灵或明胶的细菌生化鉴定板中，37℃恒温培养24 h后，按要求加入相应试剂，通过细菌鉴定系统软件读取判定结果。

1.2.5 药敏试验 对具有典型特征的4株分离菌株，制备0.5麦氏浊度试验菌悬液，吸取200 μL均匀涂布于直径90 mm的营养琼脂培养基上，放置6片抗菌药物药敏纸片，倒置在培养箱中，37℃培养24 h～48 h，测定抑菌圈直径，判断耐药(R)，高敏(S)和中敏(I)。

2 结果

2.1 流行病学调查结果

对西山区辖区内涉及养殖羊的碧鸡、海口、团结街道办事处及西山风景区管理局猫猫箐居委会共621户，逐一检查38 225只羊的体表，结合调查表回收的方式，了解该病羊发病时间、数量、品种、日龄和季节以及发病病程、临床表现(表1和表2)。

表1 伪结核病发病羊只调查统计表

由表1可见，621养羊户中有272户的羊只有体表内外生长脓包的现象，发病户占总户数的43.8%。普查38 225只羊，共查出病羊3 942只，平均发病率为10.3%，病死率低，占0.1%。发病羊只以成年羊只为主，2月龄以下的羔羊不发病，2月龄至1岁以内的羊散发。羊局部脓灶主要分布在体表，占99.8%。内脏型占0.13%，混合感染占0.025%，内脏型与混合型的发病率较低。

由表2可见，莎能羊发病率为19.65%，更易感。山羊发病率8.89%，绵羊未见感染。临床表现为羊只体表内外脓肿，最早3 d，最晚15 d～20 d可见体表明显肿块。

2.2 细菌分离株的形态和培养特征

脓汁和培养物的涂片染色镜检，可见G+球杆状、棒状和少量丝状杆菌，无芽胞和荚膜，抗酸染色阴性。血清琼脂平板和鲜血琼脂平板上菌落白色，部分偏黄，干燥、凸起、不透明。菌落周围有狭窄的β溶血环；麦康凯平板上不生长；普通琼脂平板上生长贫瘠。血清肉汤在24 h后混浊，且有白色菌膜出现。

2.3 PCR 鉴定及序列分析

4株分离菌株PCR扩增获得与预期相符的条带，分别为1 465 bp(图1)：去除前面引物序列后，经Blast在线分析比对，4株分离菌16 S rRNA序列与GenBank已收录的伪结核棒状杆菌(CD070,登录号NR-117210.1)相应的基因序列同源性最高，均为100%，表明细菌的16 S rRNA序列较为稳定，所有菌株未产生基于16 S rRNA的变异。

2.4 生化鉴定结果

2株分离菌株KM-1及KM-2纯培养皿中的细菌，按梅里埃棒状杆菌鉴定要求收集细菌达到OD=6.0接种后培养24 h，加入试剂盒中相应化学试剂，通过系统鉴定与标准符合度为99.1%，详细结果见表3，最终判定为伪结核棒状杆菌。

表2 不同品种羊伪结核病发病情况

2.5 致病性试验

将38只昆明种分成19组，每组2只，待小鼠适应3 d后进行腹腔注射，取新鲜血清肉汤培养物以每只小鼠注射0.5 mL剂量,分离菌株在注射的2 d～4 d内除1只外,全部死亡,对照组无异常反应,表明所有分离菌株有较强毒力。

M.DNA标准DL 2 000;1～4.分离菌株PCR；5.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1-4.PCR products of 16 S rRNA；5.Negative control

图1伪结核杆菌16 S rRNA PCR鉴定

Fig.1 PCR identification of 16 S rRNA ofCorynebacteriumpseudotuberculosis

表3 伪结核棒状杆菌生化鉴定表

续表3

试验Test底物Substrate剂量/mgQTY反应酶Reactioneznzyme结果ResultsRIBXYLD⁃核糖D⁃ribose1．4发酵(核糖)Fermentation(ribose)+MAND⁃木糖D⁃xylose1．4发酵(木糖)Fermentation(xylose)-MALD⁃甘露醇D⁃mannitol1．36发酵(甘露醇)Fermentation(Mannitol)+LACD⁃丙二酸盐D⁃malonate1．4发酵(丙二酸盐)Fermentation(Malonate)-SACD⁃乳糖(牛源)D⁃lactose(Cattle)1．4发酵(糖原)Fermentation(Glycogen)-GLYG糖原Glycogen1．28发酵(乳糖)Fermentation(Lactose)-CAT七叶灵或明胶Svenleavesorgelatin-触酶Catalase-

2.6 药敏试验

2株伪结核棒状杆菌KM-1和KM-2药敏试验表明，此次分离菌对多种药物均表现敏感，头孢噻肟/棒酸、庆大霉素、恩诺沙星等16种抗菌药物高敏，但对复方新诺明、链霉素、甲硝唑等7种药物表现抗性，详细抗性分类见(表4)。

表4 伪结核棒状杆菌药敏试验

注：≥15 mm以上高敏,10 mm～14 mm中敏，≤10 mm以下不敏感。

Note：≥15 mm is sensitive,10 mm～14 mm is intermediate，≤10 mm is resistant.

3 讨论

伪结核棒状杆菌是一种兼性胞内寄生菌，主要感染绵羊和山羊，引起的疾病称为羊干酪性淋巴结炎(伪结核病)，在疾病的临床表现方面，其主要特点是淋巴结化脓，本病目前在世界范围内广泛流行，国内也有很多本病的报道，但未见区域性流行病学研究，本研究对昆明地区伪结核病进行了全群调查，结果表明昆明市西山区自2005年首次发现本病，2012年—2015年呈暴发流行，本病已成为昆明地区养羊业中一种潜在的、造成严重经济损失的消耗性疾病，其平均发病率为10.3%，病死率为0.1%。发病率与年龄关系密切，发病羊只以成年羊只为主，2月龄以下的羔羊不发病。 绵羊暂时未见感染，这情况与杨雪红等[1-2]报道的绵羊为易感动物的情况有差异，主要原因可能是绵羊饲养量及规模较小，本次流行病学调查也表明不同品种、性别的山羊均易感，奶山羊更易感染，这与农业养殖过程中挤奶环节不注意卫生直接相关。此外，在本次调查过程中，羊伪结核棒状杆菌感染未见明显季节变化，一年四季均可发生，全群感染康复后发病率会明显降低。羊局部脓灶常见于体表，内脏和混合较为少见，调查表明除心脏未见长脓肿外，内脏器官均见过脓肿。本次调查发现昆明地区自2005年发现羊伪结核病至今，难以根除的主要原因之一是养殖户对该病的危害认识不足，未对病羊采取隔离治疗，因该病致死率极低，便疏于治疗，让脓肿自行破溃愈合，致使含大量病原菌的脓汁随病羊的走动污染圈舍、放牧场所，同时因该地区饲养方式为放牧，难以建立健全的消毒制度而使病原菌长期存在。

对羊伪结核病的诊断方面，由于临床症状明显，很容易做出诊断，但也有少量隐性感染者可继发感染，需要实验室诊断，细菌鉴定包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中细菌的分离培养最为关键，近年来，各种基因诊断技术在细菌检测中不断开发、利用，尤其是基于聚合酶链反应(PCR)的基因诊断技术发挥着越来越重要的作用。通过传统的细菌分离鉴定获得纯培养后，利用分子生物学技术建立对该病快速而特异的诊断方法,并在此基础上分析其序列变异，本研究表明通用引物能够快速敏感完成细菌种属鉴定[4-5]，序列比对未见有任何变异出现，表明16 S rRNA高度保守,昆明市西山区发现的伪结核病局部流行毒株与GenBank收录的山羊菌株序列高度一致。

羊伪结核病是国际公认的难以净化的动物疫病，本病国内也不同程度发生[6-8]，难于防治的重要原因是脓肿表面包有一层厚而致密的纤维性肉芽肿性包囊, 致使药物难以通过这层包囊渗入其内发挥作用，因而全身用药效果不佳，局部用药手续繁琐，难于根除[9-10]。通过优化抗菌药物合理用药方案可减少抗菌药物的滥用及耐药菌的生成，本研究在药敏试验的基础上，筛选出敏感抗菌药物用于临床治疗，对筛选出的高敏抗菌药硫酸庆大霉素及氟苯尼考采用早期封闭注射，对晚期病例采用手术治疗，清洗消毒后外敷油剂青霉素，并对农户养殖山羊全群用聚维酮碘溶液带羊消毒，并对周围环境用苯扎溴铵溶液消毒，防控过程中，筛选出的高敏抗菌药对出现明显伪结核病症状的山羊无明显治疗效果，但通过手术治疗及环境消毒，减轻并控制了本病的发生及流行，取得了较好的综合防控效果。

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IsolationandIdentificationofGoatCorynebacteriumpseudotuberculosisinXishanDistractKunming

ZHENG Guo-ying1,MA Yu-xin2,3,LI Tai-xian4,YIN Hai-ying1,SHAO Qing-yong2,XIN Ai-guo2, GAO Hua-feng2,LI Zhi-ming1

(1.BureauofXishanAgricultureandForester,Kunming,Yunnan,650100,China;2.InstituteofYunnanAnimalScienceandVeterinary,Kunming,Yunnan,650224,China;3.YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China; 4.NeighborhoodOfficesofHaikouStreet,XishanDistractKunmingCity,Kunming,Yunnan,650114,China)

Caseous lymphadenitis (CLA) is a chronic,pyogenic,contagious disease of goat that imposes considerable economic losses for farmers which is caused byCorynebacteriumpseudotuberculosis.To control the epidemiology of this disease,we carried out a survey about the epidemiology of this disease in Xishan distract Kunming city during 2016.The results showed that 10.3% of total sheep and goats were infected and the mortality was 0.1%.Bacteria were isolated and identification by DNA 16S PCR and bacterial biochemical identification and finally identificated asCorynebacteriumpseudotuberculosis.The antibacterial resistance of 4 strains to 36 drugs were determined by the methods of disk diffusion and serotypes were tested using glass plate agglutination.The results showed thatCorynebacteriumpseudotuberculosiswas sentisitive to most antimicrobials but had a high resistance to trimethoprim and metronidazole.This results will help to cure the disease in early stage in Kunming area.

Corynebacteriumpseudotuberculosis; epidemiology; isolation and identification; drug susceptibility test

2017-01-03

昆明市西山区2016年度科技项目；国家现代肉羊产业技术体系项目(CARS-39)

郑国英(1968-)，女，云南昆明人，高级兽医师，主要从事动物传染病诊断及防控工作。*

S858.27

:A

:1007-5038(2017)09-0032-06