猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化与鉴定

周景明,贾 蕊,刘红亮,祁艳华,聂守一,陈 冰,张改平,王爱萍

(郑州大学生命科学学院，河南郑州 450001)

猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化与鉴定

周景明,贾 蕊,刘红亮,祁艳华,聂守一,陈 冰,张改平,王爱萍*

(郑州大学生命科学学院，河南郑州 450001)

为了获得具有良好免疫原性的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白，对pET-28a-ORF2-BL21重组菌种进行IPTG诱导表达，利用镍亲和层析法纯化可溶性重组蛋白，并利用Western blot和ELISA鉴定其免疫反应性。结果表明，表达的重组蛋白分子质量约为 26 ku，主要以可溶性蛋白的形式存在，纯化后的蛋白纯度可达到 90%以上，浓度为1.31 mg/mL，产量为30.6 mg/L菌液。Western blot和间接ELISA证实,重组蛋白能够与PCV2阳性血清反应。结果表明，所制备的Cap蛋白具有较高的纯度和较好的免疫反应性，有望用于PCV2抗体检测免疫试纸的研制。

猪圆环病毒2型；核衣壳蛋白；蛋白纯化；鉴定

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，20世纪90年代早期Allan G M等从患有PMWS的病猪体内分离出PCV2。PCV2有3个主要的开放阅读框(open reading frame，ORF)，分别是ORF1(945个核苷酸，51-995位)，ORF2(702或705个核苷酸，位置是1734/1735-1030/1033/1034)和ORF3(315个核苷酸，671-357位)[1]。其中，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白，即Cap蛋白[2]。Cap蛋白由233个或234个氨基酸组成，分子质量约为28 ku[3]。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白和主要的免疫原性蛋白，在病毒感染免疫反应中起着重要作用，包含病毒主要的抗原表位，具有良好的免疫原性，是刺激机体产生免疫应答的重要抗原，在流行病学诊断及疫苗学研究中起到关键作用[4-5]。因此，Cap蛋白是构建重组疫苗和临床检测的首选蛋白[6]，在PCV1和PCV2之间不存在抗原交叉反应[7]。为了获取具有良好免疫反应性的PCV2重组Cap蛋白，本试验利用原核表达系统表达并纯化可溶性的重组Cap蛋白，并对纯化的蛋白进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种pET28a-ORF2-BL21(DE3)和pET28a-BL21(DE3)，郑州大学动物分子免疫实验室保存；IPTG、卡那霉素和Bradford蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio公司产品；HRP标记的羊抗猪酶标二抗，Abbkine公司产品；BeyoGoldTM His-tag Purification Resin，碧云天生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCV2 Cap蛋白的诱导表达 将本实验室保存的菌种pET28a-ORF2-BL21(DE3) 2 μL接种到含有10 μg/mL卡那霉素的经过高压灭菌的2 mL LB液体培养基中，37℃、220 r/min在摇床中培养过夜；次日取100 μL pET28a-ORF2-BL21菌液接种到含有10 μg/mL卡那霉素的经过高压灭菌的100 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养约1.5 h，测菌液OD值，当OD值在0.6～0.8之间，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37℃、220 r/min诱导表达过夜。同时用pET28a-BL21(DE3)作阴性对照。通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定重组Cap蛋白表达情况。

1.2.2 PCV2 Cap蛋白的可溶性分析 将100 mL诱导表达后的菌液转移到离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清，加10 mL非变性裂解缓冲液重悬菌液，用超声破碎仪破碎菌体，设定超声破碎的工作时间为10 min，超声3 s，间歇3 s，总工作时间为5 min，超声过程中要将离心管置于冰水混合物中。超声结束后，取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min离心2 min，收集上清，并用1 mL PBS重悬沉淀，各取20 μL上清和重悬的沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析蛋白的可溶性。

1.2.3 PCV2 Cap蛋白的纯化 超声破碎后的菌液上清用镍亲和层析法纯化重组Cap蛋白。取1 mL层析介质装柱，用2倍体积的平衡缓冲液平衡层析介质3次。将超声破碎后的菌液4℃、12 000 r/min离心20 min，取上清过滤后上柱，流速控制为0.5 mL/min，收集流出液以待后续分析；用2倍柱体积的洗涤缓冲液(2 mmol/L imidazole,50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl)洗涤柱子5次，以去除杂蛋白；用2倍柱体积的洗脱缓冲液(50 mmol/L imidazole,50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl)以0.5 mL/min的流速洗脱10 次，将洗脱液收集到不同的离心管中，立即将收集的蛋白梯度透析。透析结束后，取200 μL透析后的蛋白样品，以备后续鉴定用。

1.2.4 重组PCV2 Cap蛋白鉴定

1.2.4.1 SDS-PAGE与Western blot鉴定 纯化的Cap蛋白进行SDS-PAGE电泳；用转膜仪将蛋白条带转至NC膜上；转膜完毕后，将NC膜置于50 mL/L脱脂奶中封闭，过夜；次日取出NC膜，PBST洗涤3次，加入PCV2阳性血清(1∶100稀释)，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，加入HRP标记羊抗猪IgG(1∶1 000稀释)，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，用化学发光显色，观察结果。

1.2.4.2 Cap蛋白浓度测定 用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定透析后的蛋白浓度。采用微孔酶标仪法，取完全溶解蛋白标准品10 μL，用9 g/L NaCl或PBS稀释标准品稀释至250 μL，使终浓度为0.2 mg/mL。5×G250染色液使用前请颠倒3次～5次混匀，取1 mL 5×G250染色液，加入4 mL双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存1周。将稀释后的标准品分别取0、2、4、6、8、12、16、20 μL加到96孔板中，加PBS稀释液补足到20 μL。将样品作适当稀释，取20 μL到96孔板的样品孔中(表1)。各孔加入200 μL稀释后的1×G250染色液，室温放置5 min。用酶标仪测定OD 570 nm的吸光度。根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

1.2.4.3 间接ELISA法测定Cap蛋白免疫反应性 向酶标板中每孔加入100 μL 3 μg/mL纯化的重组Cap蛋白，包被过夜；次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，加50 g/L脱脂奶37℃孵育1 h；弃去封闭液，用PBST洗涤3次，加入倍比稀释(1∶500～1∶128 000)的PCV2阳性血清，同时设PCV2阴性血清对照，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，显色试剂显色后用酶标仪测OD 450 nm值，分析纯化蛋白与标准PCV2阳性血清的免疫反应性。

表1 蛋白浓度测定加样量

2 结果

2.1 PCV2 Cap蛋白的诱导表达

重组菌株pET28a-ORF2-BL21(DE3)和对照菌株pET28a-BL21(DE3)经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析Cap蛋白的表达情况，结果显示(图1)，与pET28a-BL21(DE3)相比，pET28a-ORF2-BL21(DE3)在26 ku附近有1条明显的表达条带，与预测的Cap蛋白分子质量大小相符合。

2.2 重组Cap蛋白的可溶性分析

重组菌株pET28a-ORF2-BL21(DE3)在30℃诱导过夜，超声破碎后取上清和沉淀上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，pET28a-BL21(DE3)作阴性对照，结果显示(图2)，Cap蛋白主要存在于超声破碎后的上清中，以可溶性蛋白的形式存在。

2.3 重组Cap蛋白的纯化

用镍亲和层析法纯化蛋白，SDS-PAGE电泳的结果显示(图3),在用含有50 mmol/L与250 mmol/L咪唑的洗脱液中均发现纯度达到90%以上的重组Cap蛋白。

2.4 Cap蛋白Western blot鉴定

对纯化后的蛋白进行Western blot分析，用PCV2标准阳性血清做一抗，HRP标记的羊抗猪IgG做酶标二抗，结果表明(图4)，大约在26 ku处的目的蛋白条带显色，用PCV2阴性血清做一抗的阴性对照不显色，说明PCV2重组Cap蛋白能与PCV2标准阳性血清特异性的结合，具有良好的免疫反应性。

M.蛋白分子质量标准;1.IPTG诱导表达过夜后的pET28a-BL21(DE3)；2.IPTG诱导表达过夜后的pET28a-ORF2-BL21(DE3)

M.Protein molecular weight Marker;1.pET28a-BL21(DE3) inducted with IPTG for overnight；2.pET28a-ORF2-BL21(DE3) inducted with IPTG for overnight

图1重组Cap蛋白的表达鉴定

Fig.1 Identification of the expression of recombined Cap protein

M.蛋白分子质量标准;1.诱导表达后的pET28a-BL21(DE3)；2.诱导表达后的pET28a-ORF2-BL21超声破碎后上清；3.诱导表达后的pET28a-ORF2-BL21超声破碎后沉淀

M.Protein molecular weight Marker;1.pET28a-BL21(DE3) inducted with IPTG；2.Supernatant of pET28a-ORF2-BL21 after ultrasonic breaking；3.Precipitation of pET28a-ORF2-BL21 after ultrasonic breaking

图2 Cap蛋白的可溶性分析

Fig.2 Solubility analysis of recombined Cap protein

M.蛋白分子质量标准;1、7.穿流液；2、3.含10 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱下的杂蛋白；4、5.含50 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱下的目的蛋白；6.含250 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱下的目的蛋白；8.纯化后的柱子

M.Protein molecular weight Marker;1,7.Overflow liquid；2,3.Impurity protein by washing buffer with 10 mmol/L imidazole；4,5.Purified protein by washing buffer with 50 mmol/L imidazole；6.Purified protein by washing buffer with 250 mmol/L imidazole；8.Stuffing of purified Ni-NTA

图3重组蛋白Cap的SDS-PAGE鉴定结果

Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombined Cap protein

M.蛋白分子质量标准;1.PCV2阳性血清做一抗；2.阴性对照(PCV2阴性血清做一抗)

M.Protein molecular weight Marker;1.Immunoblotting reaction using swine positive serum against PCV2；2.Immunoblotting reaction using swine negetive serum against PCV2

图4纯化的Cap蛋白Western blot鉴定结果

Fig.4 Western blot analysis of recombined Cap protein by anti-PCV2 antibodies

2.5 重组Cap蛋白浓度测定

根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行操作，酶标仪读数见表2，其中1号～8号是稀释后的BSA标准品不同浓度的OD 570 nm吸光光度值，9号～12号是不同浓度的重组Cap蛋白的OD 570 nm吸光光度值，根据1号～8号的数值和对应的稀释后标准品的蛋白浓度得到标准曲线(图5)方程为：

y=0.084x+0.688；R2=0.998。

当 R2>0.97 时测量结果准确可信，因此将待测样品的OD值代入标准方程并求平均值得到纯化的重组Cap蛋白的浓度为1.31 mg/mL，产量为30.6 mg/L菌液。

表2 蛋白浓度测定OD 570 nm值

图5 重组蛋白浓度的标准曲线

2.6 重组Cap蛋白免疫反应性鉴定

采用间接ELISA测定PCV2标准阳性血清抗体效价，当血清1∶4 000稀释时，阳性值为0.257，阴性值为0.122，此时阳性值是阴性值的2.1倍，因此Cap蛋白与PCV2阳性血清反应效价能达到1∶4 000。随着稀释度的增加，标准阳性血清的OD 570 nm值呈下降的趋势(图6)，而阴性血清的OD 570 nm值基本保持不变。

图6 纯化蛋白的ELISA检测

3 讨论

PCV2是环状单链的DNA病毒，能够引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征，患病仔猪表现为生长迟缓、体重降低和死亡[8]。PCV2 ORF2编码的Cap蛋白是PCV2的结构蛋白，能够刺激机体产生特异性的中和抗体[9-10]。Cap蛋白含有高度保守的抗原表位，可以诱导PCV2阳性动物产生超强免疫应答，因此Cap蛋白可以作为疫苗研制和PCV2诊断技术的抗原[10-11]。目前，Cap蛋白的表达系统有细菌表达系统[9-10]、杆状病毒表达系统[11-12]、粉纹夜蛾表达系统[13]、活载体表达系统[14]等。大肠埃希菌表达系统是最常用的细菌表达系统，具有遗传背景清楚、生长迅速、培养简单、重组子稳定等特点[15]。本研究采用大肠埃希菌表达系统，表达并纯化得到的重组Cap蛋白分子质量约为26 ku，并以可溶性蛋白的形式存在，用镍亲和层析法纯化重组Cap蛋白，纯度可达到90%以上，纯化得到的产量为30.6 mg/L菌液。Western blot证实，重组蛋白与PCV2阳性血清反应。通过间接ELISA测定重组Cap蛋白与PCV2阳性血清反应效价能达到1∶4 000，表明该蛋白有良好的免疫反应性，本研究可为免疫胶体金抗体检测试纸的研制提供抗原。

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PurificationandIdentificationofRecombinantPorcineCircovirusType2CapsidProtein

ZHOU Jing-ming,JIA Rui,LIU Hong-liang,QI Yan-hua,NIE Shou-yi,CHEN Bing,ZHANG Gai-ping,WANG Ai-ping

(SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan,450001,China)

To obtain the immunogenic PCV2 Cap protein,recombinant bacteria pET-28a-ORF2-BL21 was induced with IPTG,the soluble recombinant protein were purified with Ni-affinity chromatography column,then the immunoreactivity of the purified recombinant capsid protein was identified by Western blot and indirect ELISA.The result showed that soluble recombinant protein with molecular weight of about 26 ku was expressed in recombinant bacteria pET-28a-ORF2-BL21 after induced with IPTG.The purity of purified Cap protein was above 90 % and the concentration was 1.31 mg/mL.The yield of protein was 30.6 mg per liter bacteria liquid.Western blot and indirect ELISA showed that the purified protein could react with the PCV2 positive serum.The recombinant Cap protein prepared in this study has high purity and strong immunoreactivity,which has the potential to be used for the development of colloidal gold immunochromatographic strip for detection of PCV2 antibody．

PCV2;Cap protein;purification;identification

2017-01-23

国家重点研发计划项目(2016YFD0500704)；郑州市科技创新团队项目(131PCXTD622)

周景明(1972-)，男，河南新野人，副教授，博士，从事分子免疫学与免疫学检测技术研究。*

S852.659.2;Q789

:A

:1007-5038(2017)09-0023-05