FISH检测子宫颈石蜡组织切片与液基薄层细胞中hTERC基因的比较

潘晓婷，吴 秀，张哲珺，甘丹卉，蒋光愉

FISH检测子宫颈石蜡组织切片与液基薄层细胞中hTERC基因的比较

潘晓婷，吴 秀，张哲珺，甘丹卉，蒋光愉

hTERC基因；FISH；石蜡包埋组织；蛋白酶K；液基薄层细胞；胃酶

子宫颈癌是女性生殖系统中最常见的肿瘤之一，近几年子宫颈癌的发病率呈逐年上升且发病年龄日趋年轻化[1]。在临床工作中对子宫颈癌及癌前病变的筛查要求越来越高。目前各大医院相继开展FISH技术检测子宫颈hTERC基因检测应用。同时已有很多子宫颈液基细胞涂片FISH技术检测的相关报道。而子宫颈石蜡包埋切片FISH技术检查子宫颈hTERC基因在临床应用比较少。本文针对子宫颈石蜡包埋组织切片和液基薄层细胞学(thinprep cytologic test, TCT)标本用FISH技术检查子宫颈hTERC基因实验操作进行比较观察。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集来自暨南大学附属第一医院病理科诊断为子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelical neoplasia, IN)1～3的子宫颈石蜡包埋组织50例和TCT标本63例。分成两组进行实验，分别为石蜡组织样本组和TCT样本组。

1.2 主要试剂 胃蛋白酶，蛋白酶K，探针GLP TERC CSP3(探针由北京金菩嘉医疗公司提供)，2×SSC，乙醇。

1.3 主要仪器 OlympusBX51正置荧光显微镜，Dake原位杂交仪，德国耶拿CCD摄像头，俄罗斯VIDEOTEST荧光原位杂交图像分析软件，电热恒温水箱。

1.4 方法 石蜡组织样本组FISH实验操作过程：(1)样本玻片制备：常规甲醛固定石蜡组织，3 μm厚切片，用硅胶涂胶玻片，65 ℃烤片2～3 h。这一处理使高温变性玻片上组织的DNA不致掉片。(2)切片脱蜡：二甲苯5 min×3次，100%、95%、80%、70%梯度乙醇复水，去离子水冲洗。(3)酶消化：预处理微波用H档5 min煮沸蒸馏水，再转至ML档将切片放置水中20 min。2×SSC漂洗5 min×2次。37 ℃蛋白酶K消化5～6 min，室温下用2×SSC漂洗5 min×2次，乙醇梯度脱水固定，自然干燥。(4)变性、杂交：由金菩嘉公司提供的探针，在避光环境中配置探针混合液，将混合液滴于杂交区域，封片。放置Dake原位杂交仪，83 ℃ 5 min变性，42 ℃ 16 h杂交。(5)洗涤：在温度46 ℃下玻片置于2×SSC 5 min，1%NP-40 3 min，室温下70%乙醇3 min。玻片自然干燥后加DAPI复染液，放置数分钟后即可OlympusBX51正置荧光显微镜下观察。

TCT样本组FISH实验操作过程：(1)样本玻片制备：取TCT检查剩液约10 mL，1 200g离心10 min，1×PBS洗涤2遍后离心去除上清液；胶原酶B 5 mL(1 mg/mL)37 ℃水浴30 min，再次离心。加入5 mL去离子水，低渗重新吹打悬浮细胞。37 ℃水浴30 min，加2 mL固定液(甲醇 ∶冰乙酸=3 ∶1)预固定5 min。离心后弃上清液，再加5 mL固定液重复以上“固定、去除上清液的”步骤2次，用沉淀的细胞制备成一定浓度的溶液，将细胞滴于玻璃上，放置56 ℃ 烤片3 h老化细胞片。(2)酶消化：37 ℃胃蛋白酶消化30 s～20 min，室温下用2×SSC 5 min、2次漂洗，乙醇梯度脱水固定，自然干燥。(3)变性杂交：由金菩嘉公司提供的探针，在避光环境中配置探针混合液，将混合液滴于杂交区域，封片。放置Dake原位杂交仪，75 ℃ 5 min变性，42 ℃ 16 h杂交。(4)洗涤：在温度46 ℃下玻片置于2×SSC 5 min，1% NP-40 3 min，室温下70%乙醇3 min。玻片自然干燥后加DAPI复染液，放置数分钟后即可OlympusBX51正置荧光显微镜下观察。

1.5 结果判定 (1)信号判断：用OLYMPUS BX51荧光显微镜DAPI/FITC/TRITC三单通滤光镜观察计数，采用Imstar-FISH 3.0软件进行图像采集及处理。选择荧光信号清晰细胞核形态完整的间期细胞进行计数，每例至少分析100个细胞，统计异常细胞比例。记录红色(hTERC)信号数和绿色(CSP3)信号数，正常细胞红色信号和绿色信号各为2个，异常细胞为红色信号≥3个，绿色信号≥2个细胞。(2)阈值建立：选用20例正常子宫颈脱落细胞进行FISH检测，每例至少分析100个细胞统计异常细胞比例。计算阈值=平均数(M)+3×标准差(SD)，通过计算本次实验采用有效阳性阈值=4.95%[2]。

1.6 结果判断 每例样本随机计数至少100个细胞，如果异常细胞比例大于阳性阈值则判断有hTERC基因扩增(FISH阳性，图1、2)，如果异常细胞比例<4.95%则判断无hTERC基因扩增(FISH阴性，图3、4)。

①②③④

图1 石蜡组织样本组：hTERC阳性，FISH检测显示异常细胞红色(hTERC)信号≥3个和绿色(CSP3)信号≥2个 图2 液基薄层细胞样本组：hTERC阳性，FISH检测显示异常细胞红色(hTERC)信号≥3个和绿色(CSP3)信号≥2个 图3 石蜡组织样本组：hTERC阴性，FISH检测显示正常细胞红色(hTERC)信号和绿色(CSP3)信号各为2个 图4 液基薄层细胞样本组：hTERC阴性，FISH检测显示正常细胞红色(hTERC)信号和绿色(CSP3)信号各为2个

2 结果

将石蜡组织样本组和TCT样本组在酶消化时间、背景干净度、细胞数量满意度、荧光信号满意度、荧光信号杂交成功率等两组数据相比，石蜡组织样本组消化时间比较恒定，时间短，易掌控。而TCT样本组酶消化时间有长有短，难掌控。因为细胞受液基薄层细胞保存液固定和细胞在样本制备过程中低渗处理细胞膨胀程度不同的影响。石蜡组织切片在处理后背景干净度、细胞数量满意度、荧光信号满意度以及杂交成功率均较子宫颈脱落细胞制片高(表1)。

表1 石蜡组织切片与液基薄层细胞FISH实验结果对比

3 讨论

FISH是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，在荧光显微镜下对细胞和(或)组织原位观察并分析细胞和内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信号。FISH技术近几年广泛用于临床医学检测，在检测染色体数量和结构的畸变上非常有效。

FISH技术用于石蜡包埋组织检测hTERC基因优点：细胞数量足够多，而且组织结构清晰、集中，酶消化时间易掌控，处理后玻片背景干净度，细胞数量满意度，细胞形态，荧光信号满意度以及杂交成功率均较子宫颈脱落细胞制片高，石蜡包埋组织检测可在选片部位正确的基础上避免血液、黏液的干扰[3]。

在临床工作中，各级医院病理医师的制片、阅片水平存在一定差异，从而导致病理诊断结果存在一定主观偏倚，而且有时CIN相邻两级之间很难区分。而FISH检测石蜡组织切片，组织结构完整清楚，子宫颈细胞易辨认，而且对于CIN在相邻两级之间难以分级时通过FISH检测可以选择相应区域的细胞阅片计数。因此用FISH技术检查子宫颈组织hTERC基因可提高CIN病理分级的准确性，对于临床CIN的治疗和随访有着更深厚的意义。

FISH技术用于子宫颈细胞悬液样本检测hTERC基因扩增成功关键：(1)制备细胞片时，要注意包括样本黏液、血液、炎细胞、细菌、杂质、细胞在玻片分布均匀等方面的处理。子宫颈细胞悬液样本检测hTERC基因存在很多外在因素影响。例如上皮细胞量、血液、炎细胞、黏液、细菌、杂质等均会影响杂交信号以及结果判读。而且子宫颈脱落细胞易受生理周期及外界因素所影响，不同年龄妇女以及月经周期中的不同时间子宫颈上皮厚薄以及脱落细胞的成分均有不同的变化，可能会影响到检测的荧光信号及结果。因此每例患者的标本均不一样，对于整个实验检测影响就会存在不同的差异。(2)样本玻片预处理过程中胃蛋白酶消化时间的控制很重要，观察玻片制备后标本类型来控制玻片消化时间。标本的类型包括有裸核的标本和无裸核的标本，有裸核的标本细胞形态根据全裸核和部分裸核来调节消化时间，无裸核的标本根据细胞质厚薄，细胞核的大小来确定消化时间。(3)杂交荧光信号的观察读片：注意炎细胞和子宫颈细胞辨别，避开重叠细胞区，选择细胞分布均匀的平坦区来计数。

FISH技术用于石蜡包埋组织检测hTERC基因有两方面的问题要注意：(1)切片本身的因素，即最初组织的处理，固定情况，石蜡包埋的过程以及样本的年限、切片厚度等。因为组织类型、切片厚度、固定时间等均会使得理想的消化时间发生改变[4]。(2)石蜡包埋切片的处理因素，包括杂交前的酶消化、杂交后的洗涤等。因为杂交前的酶消化是FISH检测的关键步骤[5]，杂交后的洗涤温度和pH值对荧光信号强弱有密切关联。只要保持这两方面的实验室条件稳定，整个实验检测稳定性就很好，差异不大。在上前述因素中最关键最难把握就是酶消化环节，因此把握好杂交前酶消化处理环节，是获取良好信号的前提。在石蜡包埋切片FISH技术中，因为组织标本之间的个体差异和每个实验室制片过程的差异，因此建议在不同的实验室甚至不同批次的样本中在进行FISH技术杂交检测前，首先要对酶的消化时间进行调整。

本组实验存在不足，样本例数少，如果有更大样本量支持，结果将更有科学依据和临床意义。

[1] Jemal A, Siegel R, Xu J,etal. Caneerstatisties,2010[J]. CA Caneer J Clin, 2010,60(5):277-300.

[2] 蒋光愉, 甘丹卉, 潘晓婷. hTERC基因检测在宫颈上皮内瘤变差异化治疗的应用[J].暨南大学学报, 2012,33(4):382-386.

[3] 伍军平, 王建六, 罗 新. 如何利用TERC基因做好宫颈癌筛查分流及随访工作[J]. 中国计划生育和妇产科, 2016,8(10):7-11.

[4] 陈 慧, 陈 淳, 王 华, 等. 利用相差显微镜观察FISH检测石蜡包埋切片的理想消化程度[J]. 临床与实验病理学杂志, 2013,29(7):809-810.

[5] 陈顺平. FISH中酶消化细胞的几点体会[J]. 临床与实验病理学杂志, 2010,26(1):116.

广东省广州市暨南大学附属第一医院病理科 510630

潘晓婷，女，技师。E-mail: panxiaoting5701@126.com 蒋光愉，女，主任医师，通讯作者。Tel: (020)38688436，E-mail: jianggy1107@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.030.html

R 394.2； R 737.33

B

1001-7399(2017)08-0937-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.030

接受日期：2017-04-14