转移性肾细胞癌中RSK4、CD44及MMP-9的表达及意义

马 静，余 州，李明阳，李培峰，李 侠，王 哲，范林妮

转移性肾细胞癌中RSK4、CD44及MMP-9的表达及意义

马 静1,2，余 州1,2，李明阳1,2，李培峰1,2，李 侠1,2，王 哲1,2，范林妮1,2

目的 检测核糖体S6蛋白激酶4(ribosomal S6 protein kinase 4, RSK4)、CD44和MMP-9在原发性肾细胞癌(primary renal cell carcinoma, pRCC)及转移性肾细胞癌(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)中的表达，探讨三者表达水平及与临床病理特征的相关性。方法 采用免疫组化EnVision法检测52例pRCC及48例mRCC中RSK4、MMP-9和CD44蛋白的表达，并分析三者表达的相关性及与临床病理特征的关系。结果 48例mRCC中RSK4、CD44及MMP-9的阳性率分别为75%(36/48)、68.75%(33/48)及91.7%(44/48)，而三者在52例pRCC中的阳性率分别为44.2%(23/52)、34.6%(18/52)及69.2%(36/52)。RSK4、CD44及MMP-9在mRCC中的表达高于pRCC(PRSK4=0.002；PMMP-9=0.002；PCD44=0.001)；RSK4、CD44及MMP-9表达与mRCC患者年龄、性别和肿瘤Fuhrman分级、转移部位之间未见明确相关性(P>0.05)。在mRCC中，三者之间的表达呈正相关(P=0.008)；两两相关分析发现RSK4与CD44(P=0.019)、MMP-9与CD44(P=0.05)的表达之间存在正相关，而RSK4与MMP-9(P=1.00)未见明确相关性。结论 RSK4、CD44及MMP-9在mRCC中的表达高于pRCC，提示三者可能介导肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的转移，而其具体作用机制尚有待进一步研究。

肾肿瘤；转移性肾细胞癌；侵袭转移；RSK4；MMP-9；CD44

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，早期RCC起病无明显症状，且缺乏特异性的诊断指标，导致20%～30%的患者在初次就诊时已出现不同程度的扩散或者转移，20%～40%患者术后仍会复发，且复发者预后较差。因此，探索新的肾癌恶性进展相关分子及新的治疗靶点显得尤为重要。RSK4是核糖体S6蛋白激酶(ribosomal s6 kinase, RSK)家族成员之一[1]，与细胞的增殖活化及部分肿瘤的转移进展有关。本研究小组前期实验发现RSK4在RCC的表达高于正常肾组织，并且在细胞研究中发现，过表达RSK4的肾癌细胞侵袭迁移能力增强，同时，转移相关分子CD44及MMP-9的表达也升高[2-3]。但三者在RCC中是否确实存在相关性，且其具体作用机制如何尚不清楚。本实验采用免疫组化EnVision法同时分析三种分子在转移性肾细胞癌(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)和原发性肾细胞癌(primary renal cell carcinoma, pRCC)中的表达及三者之间的相关性，并分析其与临床病理特征的关系，旨在探讨三者是否具有促RCC转移的作用，进而为RCC的治疗及预后评估提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集2007～2016年第四军医大学西京医院病理科存档的100例RCC标本，其中48例为mRCC(其中3例有原发灶)，52例为pRCC，患者均查阅临床资料并进行随访，均无肾脏及肾外的复发转移灶。pRCC组平均年龄为54.2岁(19～80岁)，其中男性45例，女性7例，男女比为6.4 ∶1，根据Fuhrman核分级进行分级：41例(78.8%)为低分级(1～2级)，11例(21.2%)为高分级(3～4级)。根据AJCC TNM进行分期统计的48例中有47例(97.9%)为低pT分期(pT1及pT2)，1例(2.1%)为高pT分期(pT4)。mRCC组的平均年龄为58.4岁(28～80岁)，其中男性41例，女性7例，男女比为5.9 ∶1。22例为Fuhrman 2级，10例为Fuhrman 3级。转移部位包括骨(23例)、软组织(如大腿、坐骨直肠窝等10例)、肺(6例)、脑(5例)、肾上腺(1例)及胆囊(1例)。同时对48例mRCC患者进行了随访，共获得29例患者的生存期资料，统计患者从出现转移至随访截止日期的生存时间，其平均时间为36个月(6～99个月)，随访截止日期为2016年10月31日。

1.2 免疫组化及结果判定 采用免疫组化EnVision法分别检测RSK4、MMP-9及CD44在RCC组织中的表达，染色方法参考文献[3]：石蜡组织块4 μm厚连续切片，常规脱蜡至水，PBS冲洗3次，RSK4应用碱修复的方法(pH 9.0，Tris-EDTA)进行抗原修复，CD44、MMP-9应用酸修复法(pH 6.0，柠檬酸-柠檬酸钠溶液)修复，后用1%H2O2-甲醇作用20 min以消除内源性过氧化物酶；5%(m/V)BSA孵育20 min以封闭非特异性结合位点，分别加入1 ∶50稀释的RSK4、1 ∶300稀释的MMP-9、1 ∶150稀释的CD44一抗，均为兔抗人单克隆抗体(Sigma公司，美国)，4 ℃孵育过夜；次日37 ℃复温1 h，PBS漂洗3次，加入EnVision(Dako公司，丹麦)二抗室温孵育40 min，PBS清洗3次后DAB显色，苏木精复染，脱水封固。同时用同种非免疫动物血清及PBS代替一抗分别作阴性对照及空白对照。阳性结果为棕黄色颗粒，RSK4阳性定位于胞质，MMP-9阳性为弥漫表达于细胞质及细胞间隙中的棕黄色颗粒，CD44阳性定位于细胞膜。根据文献[4]对染色结果进行半定量分析：每张切片从阳性细胞比例及细胞着色强度计分，其中阳性细胞比例统计范围(A)为0～100%；着色强度计分(B)：无阳性着色为0分，弱着色(呈淡棕黄色)为1分，较强着色(呈棕黄色)为2分，强着色(呈明显的棕黄色)为3分。然后将两者相乘，3个视野求和，即H score=1×a1+2×a2+3×a3，0≤H≤300，经统计，H中位数为110，故<100为阴性，≥100为阳性。

1.3 统计学分析 采取R×C列表χ2检验分析3种抗体在mRCC及pRCC之间的表达差异性及相关性，采取χ2检验3种抗体表达水平与mRCC临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier单因素生存分析检验RSK4、CD44、MMP-9表达与mRCC转移后生存期的关系。所有数据均应用SPSS 13.0软件独立分析2遍。

2 结果

2.1 RSK4、CD44、MMP-9蛋白在pRCC及mRCC中的表达 52例pRCC中，RSK4阳性率为44.2%(图1A)，Fuhrman分级分别为1级1例，2级16例，3级5例，4级1例；TNM分期分别为pT1期19例，pT2期2例。CD44阳性率为34.6%(图1B)，Fuhrman分级分别为2级14例，3级3例，4级1例；TNM分期为pT1期17例。MMP-9阳性率为69.2%(图1C)，Fuhrman分级分别为1级1例，2级24例，3级9例，4级2例；TNM分期分别为pT1期27例，pT2期4例，pT4期1例。

48例mRCC中，RSK4阳性率为75%(图1D)，Fuhrman分级分别为2级16例，3级6例；TNM分期分别为pT1期2例，pT2期1例。CD44阳性率为68.75%(图1E)，Fuhrman分级分别为2级12例，3级7例；TNM分期分别为pT1期1例，pT2期1例。MMP-9阳性率为91.7%(图1F)，Fuhrman分级分别为2级20例，3级9例；TNM分期分别为pT1期3例，pT2期1例。

综上所述，RSK4在mRCC中的阳性率为75%，在pRCC中阳性率为44.2%，两者相比差异有统计学意义(P=0.002)；CD44在mRCC中的阳性率为68.75%，在pRCC中的阳性率为34.6%，两组相比差异有统计学意义(P=0.001)；MMP-9在mRCC中的阳性率为91.7%，在pRCC中阳性率为69.2%，两组相比差异有统计学意义(P=0.002)。RSK4(P=0.002)、CD44(P=0.001)、MMP-9(P=0.002)蛋白在mRCC中的表达均高于pRCC(表1)。

表1 RSK4、CD44及MMP-9在原发性肾细胞癌及 转移性肾细胞癌中的表达

2.2 RSK4、CD44、MMP-9蛋白表达与mRCC临床病理特征的关系 本实验以58.4岁为平均年龄划分患者，两组患者RSK4、CD44和MMP-9阳性率相比差异无统计学意义(PRSK4=0.094，PCD44=0.482，PMMP-9=0.382，表2)；41例男性患者与7例女性患者中，不同抗体在不同性别之间的表达差异无统计学意义(PRSK4=0.098，PCD44=0.295，PMMP-9=0.388)；22例Fuhrman 1～2级mRCC患者与10例Fuhrman 3～4级患者中，不同抗体在不同Fuhrman分级之间的表达差异无统计学意义(PRSK4=0.472，PCD44=0.409，PMMP-9=0.935)；不同抗体在不同转移部位之间的表达差异无统计学意义(PRSK4=0.216，PCD44=0.458，PMMP-9=0.658)，但是可以看出RCC最常见的转移部位为骨组织，其次为软组织。采用χ2检验分别分析3种抗体的表达与患者各临床病理特征的关系发现：RSK4、CD44、MMP-9表达与患者年龄、性别、肿瘤Fuhrman分级和转移部位之间未发现明确相关性(P>0.05，表2)。

2.3 mRCC中RSK4、CD44及MMP-9蛋白表达的相关性分析 在mRCC中，RSK4、CD44及MMP-9的阳性率分别为75%、68.75%及91.7%，统计分析发现三者之间的表达呈正相关(P=0.008，图2)。

①A①B①C①D①E①F②A②B②C

图1 RSK4、CD44、MMP-9在同一病例的原发性肾细胞癌及转移性肾细胞癌中的表达：A.RSK4在原发性肾细胞癌中呈胞质弱阳性；B.CD44在原发性肾细胞癌中呈胞膜弱至中等强度阳性；C.MMP-9在原发性肾细胞癌中呈胞质弱至中等强度阳性；D.RSK4在转移性肾细胞癌中呈胞质强阳性；E.CD44在转移性肾细胞癌中呈胞膜及胞质强阳性；F.MMP-9在转移性肾细胞癌中呈胞质强阳性，EnVision法 图2 RSK4、CD44、MMP-9在不同病例转移性肾细胞癌中的表达：A.RSK4呈胞质强阳性；B.CD44呈胞膜及胞质强阳性；C.MMP-9呈胞质强阳性，EnVision法进一步两两相关分析发现，RSK4和CD44(r=0.337，P=0.019)、CD44和MMP-9(r=0.285，P=0.05)之间呈正相关；而RSK4和MMP-9(r=0.000，P=1.00)无显著相关性(表3)。

表2 RSK4、CD44及MMP-9表达与转移性肾细胞癌临床病理特征的相关性

表3 RSK4、CD44及MMP-9在转移性肾细胞癌中表达的相关性

CD44vsRSK4，r=0.337，CD44vsRSK4，P<0.05；MMP-9vsCD44，r=0.285，MMP-9vsCD44，P<0.05；RSK4vsMMP-9，r=0.000，RSK4vsMMP-9，P>0.05

2.4 预后分析 本组对获得随访资料的29例mRCC进行单因素及多因素生存分析，统计了自出现转移到随访截止日期患者的生存状况。结果显示，29例mRCC的中位时间为36个月(6～99个月)。单因素生存分析发现，MMP-9的表达与mRCC患者的转移后生存期相关(P=0.038)，RSK4和CD44蛋白的表达以及患者的年龄、性别、Fuhrman分级和转移部位均尚不能预测患者RCC转移后的生存期(P>0.05，表4)。

3 讨论

RCC是泌尿系统十分常见的恶性肿瘤之一，其早期诊断比较困难，因此对发病及转移机制进行深入研究，探索早期诊断、治疗、转移相关分子以及预后评估方法非常必要。首先在病例选取方面，48例mRCC中仅3例与原发病例一一对应，而其余病例可能由于患者初次未在我院就诊等客观原因未能对应原发病例，为保证原发对照组的客观性和可对照性，作者通过随访，挑选手术日期相近、分级分期相似的病例并且随访排除了后续出现转移的病例作为原发对照组。本组通过分析对比RSK4、CD44和MMP-9在mRCC中的表达，发现mRCC中RSK4、CD44和MMP-9的表达显著增强(PRSK4=0.002，PCD44=0.001，PMMP-9=0.002)，进一步统计分析发现三者表达之间呈正相关(P=0.008)，提示三者在RCC的侵袭转移中可能发挥作用，在随后进行两两比较，发现CD44与RSK4(P=0.019)、CD44与MMP-9(P=0.05)表达之间存在正相关，而MMP-9和RSK4(P=1.00)表达之间未发现明显相关性。

表4 29例转移性肾细胞癌患者复发转移单因素生存分析

RSK是一种蛋白激酶，存在于细胞质中直到促有丝分裂的作用使其移位至核中促进某些mRNA的翻译，广泛参与细胞的生长和增殖，文献中曾报道RSK4在子宫内膜癌[5]、卵巢癌[6]及乳腺癌[7]中异常表达，说明在肿瘤发生发展、侵袭转移中存在一定的作用。有文献报道RSK通过磷酸化其下游的位点EphA2与肺癌、黑色素胶质母细胞瘤和三阴型乳腺癌等恶性肿瘤的细胞运动和促进肿瘤恶性进展密切相关[8]。RSK家族的各个成员在不同组织中拥有不同的表达水平，说明它们各自不同的功能，而成员之间功能的共性仍然有待研究。RSK4作为RSK家族的新兴成员，目前的报道十分有限，所以具体功能尚不完全明确。本组前期关于RSK4与RCC的研究中发现，RSK4可能为RCC潜在的独立预后因子之一，其阳性表达往往提示RCC患者预后不良，这些结果表明RSK4可能是重要的肿瘤促进基因，在RCC的发生和演进中起重要作用[2-3]。本组前期实验发现，RSK4在RCC中的表达高于正常肾脏，细胞学试验中发现高表达RSK4的细胞系其侵袭迁移能力增强，提示其可能促进了RCC的转移[2]。本组结果表明RSK4在mRCC中的表达高于pRCC，与本组前期的猜想一致，但RSK4的这种促转移的具体机制尚不清楚。

金属基质酶家族(MMPs)和细胞表面黏附家族分子家族在肿瘤的侵袭转移中起重要作用。MMP-9是MMPs家族中被最广泛研究的成员之一，当原癌基因(Ras)活化后，会引起MMP-9转录子的聚集及后续MMP-9蛋白的生成，成熟活化的MMP-9可以降解细胞外基质中的明胶，促进肿瘤的侵袭迁移。而CD44与其配体的相互作用可以促进细胞对透明质酸的摄取及降解，增加细胞的迁移能力[9]。在肾癌中，过表达MMP-9及CD44与患者的不良预后相关[10]。另有研究发现CD44与局限性肾透明细胞癌患者术后复发及不良预后相关，但具体机制尚不明确。在本组中mRCC的MMP-9及CD44表达均高于pRCC，进一步提示两者与RCC的转移可能相关。但MMP-9阳性的mRCC患者，其转移后的生存期长于MMP-9阴性患者，提示在相同手术时间后，MMP-9阳性患者可能更早出现了转移，但该猜想仍需大量的样本资料进一步证明。

mRCC中RSK4、CD44及MMP-9三者的表达呈正相关，其中两两相关分析发现，RSK4与CD44及CD44与MMP-9之间呈正相关。查阅文献发现，MMP-9基因的转录活性及蛋白表达依赖原癌基因活化的RAS-MEK-ERK信号通路[11]，而RSK又是ERK下游表达的激酶，所以猜想RSK通过MER-ERK信号通路调节MMP-9的转录及表达。但本组组织学中未发现RSK4与MMP-9之间存在明确的相关性，而与CD44的表达呈正相关，因此需要进一步进行细胞学实验来揭示其关系。MMP-9可与CD44的胞外结构域结合，并调节CD44自身基因的转录[12]，Orgaz等[13]报道MMP-9可以通过CD44增加肌动蛋白的收缩力和p-MLC2的水平，从而增加磷酸化STAT3的水平，使MMP-9更高的表达和分泌，形成一个正反馈循环来维持肿瘤细胞的侵袭转移，与本组结果一致，即MMP-9与CD44之间的表达存在正相关性。

随访100例RCC患者，并通过免疫组化法对RCC组织中RSK4、CD44、MMP-9蛋白表达进行检测，结果显示在mRCC中3种蛋白的表达明显增高，且在mRCC和pRCC中三者表达差异较大(PRSK4=0.002，PCD44=0.001，PMMP-9=0.002)。这些结果表明RSK4、MMP-9、CD44可能是肾癌转移的促进基因，在肿瘤的发展演进中有着重要的作用，而三者组织学上表达具有相关性，其促转移的具体机制尚需后续的分子学实验进一步补充，明确上述问题，将有助于为mRCC的诊治提供更多的理论基础。

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Expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in metastatic renal cellcarcinoma and its correlation with clinicopathologic features

MA Jing1,2, YU Zhou1,2, LI Ming-yang1,2, LI Pei-feng1,2, LI Xia1,2, WANG Zhe1,2, FAN Lin-ni1,2

(1DepartmentofPathology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofPathology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Purpose To investigate the expression of RSK4 (ribosomal S6 protein kinase 4), CD44 and MMP-9 protein in primary renal cell carcinoma (pRCC) and metastatic renal cell carcinoma (mRCC), and to explore the level of expression as well as the association with clinicopathologic features and clinical outcome. Methods The expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in 52 pRCC and 48 mRCC samples was detected by immunohistochemistry and its relationship with clinicopathologic features as well as prognosis was analyzed by statistical methods. Results In the 48 mRCC samples, there were 36 (75%, 36/48), 33 (68.75%, 33/48) and 44 (91.7%, 44/48) positive for RSK4, CD44 and MMP-9, respectively, while the positive rate in 52 pRCC samples were 23 (44.2%, 23/52), 18 (34.6%, 18/52) and 36 (69.2%, 36/52), respectively. Statistical analysis showed that the expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in mRCC samples was higher than the pRCC samples (PRSK4=0.002,PMMP-9=0.002,PCD44=0.001). Furthermore, the expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in mRCC samples was not correlated with ages, genders, Fuhrman grading and the metastatic sites (P>0.05). Further analysis showed that there was positive correlation among the three proteins (P=0.008)， particularly, the expression of RSK4 and CD44 (P=0.019), MMP-9 and CD44 (P=0.05) were positively correlated, while the expression of RSK4 and MMP-9 (P=1.00) had no significance of correlation. Conclusion The expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in mRCC samples is significantly higher than pRCC samples, suggesting that the three may mediate the metastasis of renal cell carcinoma, and its specific mechanism of action remains to be further studied.

renal neoplasms; metastatic renal cell carcinoma; invasion and metastasis; RSK4; MMP-9; CD44

国家自然科学基金(81472402、81272651)

1第四军医大学病理学教研室，西安 7100322第四军医大学西京医院病理科，西安 710032

马 静，女，硕士研究生。E-mail: 854700623@qq.com 范林妮，女，讲师，通讯作者。E-mail: fanlinni@fmmu.edu.cn

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.006.html

R 737.11

A

1001-7399(2017)08-0852-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.006

接受日期：2017-05-16