兔出血症病毒研究进展

邹秋萍

（安阳市动物疫病预防控制中心，河南安阳455000）

兔出血症病毒研究进展

邹秋萍

（安阳市动物疫病预防控制中心，河南安阳455000）

兔出血症病毒（RHDV），为嵌杯病毒科兔病毒属成员，能引起3月龄以上青年或成年兔的兔出血症（RHD）。RHD是兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡性疾病，曾给世界养兔业带来了非常严重的经济损失。1984年2月，该病在中国无锡首次暴发，并迅速传播至全国各地，其典型的病理变化是呼吸系统出血、肝坏死、出血，实质器官水肿、出血、淤血。鉴于RHD的严重危害性，世界动物卫生组织（OIE）将RHD正式列为“国际动物保健编目”B类传染病，我国农业部也将其列为动物二类疾病。RHDV病毒粒子呈球形，二十面体对称，无囊膜，病毒粒子由180个相同的蛋白分子（VP60，58～60 kDaa）包裹。研究表明，作为RHDV的主要衣壳蛋白，VP60是诱导机体产生免疫反应的重要成分，在RHDV诊断和疫苗制备中有着重要的作用。为梳理国内外近期在RHDV研究的主要进展，该文就VP60诱导抗体制备，抗原表位鉴定及RHDV变异进化方面进行了概述。

1 vp60基因及VP60蛋白的结构和功能

RHDV病毒基因组为单股正链RNA，全长7 437 nt，基因组5’端没有帽状结构而是以共价结合的方式与感染性相关的VPg蛋白（viral protein genome-linked）相连，3’端具有一个短的Poly（A）尾。电镜下，RHDV病毒粒子呈球形，无囊膜，直径约为35～40 nm，二十面体对称，表面有32个高5～6 nm的圆柱状壳粒，具有嵌杯样病毒典型的杯状结构，此外电镜下还可见少数无核酸的病毒空衣壳。病毒粒子的衣壳厚4～6 nm，主要由分子量为60 kDa的结构蛋VP60聚合而成。三维结构分析表明，RHDV衣壳除具有杯状病毒典型的结构特征外，还有其独特结构，五邻体和六邻体壳粒之间由一条窄的蛋白密度带连接，这在其他杯状病毒中还未曾发现。病毒基因组含有两个重叠的开放阅读框（ORF）：ORF1、ORF2：ORF1编码一个分子量约257 kDa的多聚蛋白前体，经酶解加工后形成7种非结构蛋白A（包括聚合酶、螺旋酶、6T和蛋白酶等）和主要结构蛋白VP60；ORF2编码小结构蛋白VP10。RHDV VP60的氨基酸序列与其他嵌杯病毒相同，分为A（1-21）、B（22-300）、C（329-343）、E（344-434）和F（435-579）等六个区域。VP60由三个功能结构域构成：NTA（N-terminal arm）、S结构域（S domian）、P结构域（P domain），P结构域又可以进一步分为P1亚结构域（P1 sub-domian）和P2亚结构域（P1sub-domian）。S结构域包埋在衣壳内部由VP60的N端（66～230 aa）组成，保护病毒的基因组，含有抗原表位，具有一定的免疫原性。P结构域由VP60的C端（238～579 aa）组成，暴露在衣壳外部，而P2亚结构域在衣壳的最外面，具有较大的遗传变异性，也是抗原表位的聚集区。金明兰等对分离到的YL毒株VP60基因进行扩增分析发现，VP60蛋白A、B、D、F区变异相对较低，C、E区变异较高，因而推测A、B、D、F区在衣壳蛋白中执行更多的生物学功能。VP60参与完成病毒颗粒的包装，能与组织血型抗原（HBGAs）结合在感染过程中维持病毒的感染性，VP60还是病毒的免疫保护性抗原，在诱导机体产生抗病毒感染的免疫反应中起重要的作用。近年来国内外已主要着眼于VP60蛋白基因工程疫苗的研究，现已在大肠杆菌、酿酒酵母及昆虫细胞等多种表达系统中表达了VP60蛋白，所有这些表达产物都可以保护免疫兔抵抗RHDV的致死攻击。体外真核系统表达的VP60可以自我装配成病毒样颗粒（VLPs），其形态大小和抗原性均与天然病毒粒子相似，免疫后可以激发免疫保护反应。孙飞研究组通过对RHDV衣壳蛋白的结构进行分析以及不同病毒株的序列比对，找到一段RHDV与抗体结合起关键作用的loop区（304～314 aa）。在此基础上设计了一段包含此loop区的多肽（300～318 aa），受体结合实验证明该多肽可以和兔的组织细胞结合，且中和实验结果表明该多肽能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫以有效防御RHDV的感染。孟春春等将VP60两个抗原优势区（31～250 aa和477～579 aa）串联通用Th细胞表位的融合蛋白作为免疫原，可以激发机体抗RHDV感染的体液和细胞免疫反应。有别于传统的大肠杆菌、酵母和昆虫细胞表达系统表达的亚单位疫苗，还出现了利用转基因植物生产VP60疫苗的新途径。Castanon等将RHDV AST/89株VP60基因克隆到植物表达载体PK2，构建了表达载体PK2-VP60和双重载体PROK3，重组载体转化马铃薯叶片外植体，转基因马铃薯表达的蛋白与天然VP60相似，免疫试验证明表达物质具有良好的免疫保护效果。但鉴于VP60在植物细胞中的表达量较少，所以如何提高疫苗蛋白在植物中的表达量是未来的研究方向。Gil F等成功研制出转基因植物可饲RHD疫苗。原冬伟等以表达VP60蛋白的真核表达载体pcDNA-VP60作为新型DNA疫苗，免疫后在兔体内产生了针对RHDV的免疫保护性反应。鉴于VP60在RHDV生物学和激发机体产生免疫保护中的重要作用，还常被选作目标分子开发疫苗和构建系统发育树分析世界各地RHDV毒株的变异情况。

2 RHDV抗体制备和抗原表位鉴定

单克隆抗体是一种常用的检测工具，也是探索细胞和大分子物质的工具。抗体在RHDV检测，分析VP60蛋白结构功能和RHDV遗传进化分析中起着重要的作用。迄今为止，以纯化的RHDV病毒粒子和体外表达的VP60蛋白为免疫原制备的抗体在国内外均有报道。抗原表位是免疫原中诱导机体产生抗体的关键部位，分为构象表位和线性表位。鉴定RHDV抗体的抗原表位，对了解单克隆抗体的生物学特性以及分析病毒抗原位点的差异、病毒的分型、疾病的鉴别诊断和治疗等有重要意义。Viaplana E等用大肠杆菌表达了5个VP60的相互重叠的片断，经纯化后分别与自然感染的血清和疫苗免疫血清反应，研究这些片断的抗原性，结果表明，VP60 N端的前175个氨基酸残基与血清反应最强烈。根据这一研究结果推测，VP60 C端的抗原结构主要是构象依赖的B细胞结合位点，而N端含有连续抗原决定簇，在感染和疫苗免疫中诱导机体的免疫应答。Laurent等以RHDV病毒粒子为免疫原制备了6株RHDV单抗，并研究了6株单抗的识别特征，根据6株单抗识别表位的不同将RHDV抗原表位分为表面线性表位、表面构象表位和内部线性表位3类。Martinez-Torrecuadrada等借助由杆状病毒表达的RHDV重组病毒样颗粒制备了11株单抗与在大肠杆菌中表达了VP60蛋白的12个相互重叠片段反应，鉴定出了两段主要的抗原决定区：一段在VP60 N端的31至250位氨基酸残基之间，另一端在VP60 C端的477至579位氨基酸残基之间。但是能够识别C端主要抗原区的单抗不能识别由完整的VP60蛋白质裂解而成的主要产物，表明RHDV最主要的抗原可能位于VP60蛋白的N端。Laurent S等的研究表明，识别RHDV构象表位的E3单抗可以识别VP60的C端区域，能结合内部隐藏表位A47单抗可以识别VP60的N端区域。pGEX表达系统进一步确定单抗A47表位位于VP60 N端的129和160残基之间。杨廷亚等以针对RHDV的A3c单抗株作为靶物质应用噬菌体展示技术筛选的抗原表位集中在VP60 N端的25至38位氨基酸残基之间，其中核心氨基酸基序位于N端的29至33位氨基酸之间。宋艳华等以纯化的RHDV病毒样颗粒为免疫原得到了9株单抗，通过与截短的VP60反应鉴定出这9株单抗的抗原表位均在VP60蛋白的P结构域。孔德生等以纯化的RHDV病毒粒子为免疫原制备了6株单抗，经鉴定其中有4株识别的为构象表位，其余2株识别的为构象表位，并鉴定出这2株的抗原表位在VP60的C端。随后，孔德生等又以原核表达的VP60为免疫原筛选出针对不同亚型的RHDV型特异性单抗，并鉴定了这些RHDV型特异性单抗的抗原表位，结果表明，RHDV型特异性单抗的抗原表位均分布在VP60蛋白的P结构域。根据这些研究结果推测VP60的N端包裹在衣壳内部，C端暴露在外部且主要为抗原表位的分布区域。

3 RHDV遗传变异与进化

RHDV虽然是RNA病毒，遗传变异性却很低。1984年，RHD首次在江苏无锡等地区暴发，随后，朝鲜也暴发该病。所分离的RHDV毒株在遗传性和抗原性上都极其稳定，似乎均为同一血清型。通过比较不同地区RHDV分离株的全基因序列发现同源性都很高，氨基酸序列改变很少。VP60蛋白的N端高度保守，而C端尤其是VP60的C区（301～328 aa）和E区（344～434 aa）高度变异。鉴于C区和E区暴露于衣壳蛋白的最表面，所受的免疫压力较大，可能是高度变异的原因。20世纪90年代以来报道了有个别毒株在不同温度下其血凝性与常规毒株不同。1995年，Chasey在英国分离到了一株只能在4℃条件下才能凝集人的“O”型红细胞的特殊病毒株。1996年，Capucci在英国也分离到了一株无血凝型，无毒力的与RHDV相关的新的兔杯状病毒，称为兔杯状病毒（RCV），且表明RCV刺激机体产生的抗体对RHDV有交叉保护作用。RCV在病原性、组织亲嗜性、VP60序列等方面均与RHDV毒株不同。随后，在其他地域也有分离RCV的报道。RCV无致病性，在肠道中而不是在肝脏中增值，病毒滴度较低。Strive等发现澳大利亚RCV-A1毒株刺激机体产生的抗体对RHDV具有部分交叉保护作用且使兔群免于发病，说明RCV能保护澳大利亚兔群抵抗RHDV的感染。1998年，Capucci等分离到两株与RHDV参考毒株Bs89抗原性不同的新毒株，这两株毒株与1H8单抗株无反应，与感染Bs89参考株恢复期兔子的血清也无反应，将其命名为RHDVa。研究表明RHDVa与野生型的RHDV有着不同的遗传特性和抗原性，但具有相同的致病性。系统进化树分析RHDVa虽为一个独立的基因群，但在RHDV和RHDVa之间几乎有完全的交叉保护作用。德国、法国、美国、伊利比亚半岛也相继报道分离出了RHDVa。基于RHDVa特异性识别单抗所建立的夹心ELISA可以用来快速鉴别RHDVa和RHDV。Lavazza等用夹心ELISA对近几年来意大利RHDVa的流行情况分析发现，在1997年RHD仅由9%的RHDVa引起，而到2003年这一比例增加到了80%，说明RHDVa的流行正在逐步取代RHDV。有学者认为，RHDVa变异株的出现是由于疫苗免疫的选择压力引起的。此后，根据VP60的不同将RHDV分为6株不同的亚基因型：G1～G5和抗原变异株RHDVa即G6亚基因型。2001年，美国密歇根州报道了一种被称为密歇根兔杯状病毒（MRCV）的新型兔杯状病毒，其基因组与RHDV的同源性平均为79%。相比RHDV之间衣壳蛋白98%的同源性，不同MRCV衣壳蛋白之间的同源性仅介于89.8%～91.3%。MRCV主要引起亚临床感染，被认为只有在特定环境条件才能诱发兔出血症样的疾病。2010年在法国的家兔和野兔中发现了一种新型的RHDV突变体，并命名为RHDV2。RHDV2在病程、死亡率等方面均与RHDV不同，临床表现亚急性或慢性型症状高发。RHDV2和RHDV-RHDVa有着不同的抗原性和遗传特性，系统进化树分析表明，RHDV2为一个独立的分支，可能为兔病毒属的一个新的成员。分子流行病学分析表明，在法国首次报道RHDV2的一年里，RHDV2已经扩散到了法国各地并几乎全部代替了RHDV毒株。随后RHDV2波及德国、意大利等国家，英国的康沃尔、诺丁汉郡、萨利郡和威尔士也有检测到RHDV2的报道。RHDV2与RHDV-RHDVa核苷酸相似性平均为82.4%，氨基酸相似性平均为88.8%。所以，针对RHDV的多抗或有共同位点的单抗均能识别RHDV和RHDV2。目前，中国还没有RHDV2型病毒的报道，但已有RHDV型特异性单抗制备的报道。

4 展望

兔病毒性出血病是在20世纪末期暴发的兔急性烈性传染病，严重危害养兔业。RHDV还不能在体外长期传代培养，这在一定程度上阻碍了对RHDV的进一步研究。随着分子生物学的不断发展，一些新的研究方法正应用在RHDV的研究上并取得了一定的成果。VP60蛋白在诱导机体产生免疫，RHDV病毒粒子的组装和RHDV的遗传进化方面有着重要的作用。越来越多针对VP60蛋白的单抗为我们了解RHDV的抗原性和解析VP60的结构和功能提供了工具。线性表位或构象表位的鉴定明确了RHDV抗原位点的差异，为鉴别诊断、治疗提供了依据。RHDV进化的速度虽然很慢，但新型病毒已经出现，并正逐渐代替传统病毒的流行，这为新形势下RHD的防控带来挑战，并促使我们更加深入地研究RHD及RHDV。□