性控精液在畜牧业中的应用与使用方法

董月涛

（文安县畜牧兽医局，河北文安065800）

性控精液在畜牧业中的应用与使用方法

董月涛

（文安县畜牧兽医局，河北文安065800）

1 XY精子分离技术简介

性控精液的生产就是将XY精子分离的过程，在哺乳动物中，决定动物性别的关键是其所携带不同的性染色体。当经过减数分裂形成单倍体的配子后，X精子携带X染色体，它与卵子受精后产生雌性后代，Y精子携带Y染色体，它与卵子受精后产生雄性后代。

在哺乳动物（家畜）中，通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%～4.5%。分离精子时首先用Hoechst33342（一种相对安全的活细胞荧光染料，以非嵌入方式特异地结合到DNA双链小沟的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集区域）给精子染色，染色后精子通过流式细胞仪时，精子上的荧光染料Hoechst33342被氩离子紫外激光（～350 nm）激发，产生蓝色激发光（～460 nm）。由于X精子所含有DNA比Y精子多，结合上比较多的Hoechst33342，所激发出的荧光就比Y精子强。流式细胞仪根据荧光强度的差别分辨出哪个是X精子，哪个是Y精子。同时，由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成了包含单个X精子或者Y精子的微小液滴。因此包含精子的小液滴就被充上正电荷（X精子）或者负电荷（Y精子）。

染色的精子通过流束形成含有精子的带电液滴，在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，这个振荡装置使自喷嘴射出的液束破碎成千万个小滴，流动的精子就被分散在这些小水滴中。由于XY精子的荧光强度的不同，计算机就根据荧光量不同给小液滴带上不同电荷。当带有不同电荷的精子液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小水滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转，落入各自的收集容器中，不带电荷的水滴就进入中间的废液容器中，从而实现了细胞的分选。

2 性控精液的应用及其优势

性别控制一直是生物科学研究领域的一项重要课题，对畜牧业（尤其是养牛业）有着非常重要的意义，它可以按照生产需求控制仔畜性别，以提高畜牧业生产的经济效率。在育种方面，通过性别控制可以增加选择家畜遗传和表型性别的强度，加速育种进程。在生产实践中，X精子冷冻精液可用于直接给发情牛授精生产体内性控胚胎或者对供体超排后输精生产性控胚胎，再将胚胎收集并用于移植。

2.1 具有节省成本，提高经济效益的优势

若受性别限制的生产性状（如泌乳等）和受性别影响的生产性状（如生长速度等）的生产能力得到充分发挥，就能获得很大的经济效益。现有的胚胎性别控制技术，是将制作好的胚胎进行切割取样，再采用分子生物学手段进行胚胎的性别鉴定，按照目前的市场价格生产一枚胚胎需要1 500元左右，且只有50%的机率是雌性胚胎，而性控冻精的价格为每支200元，资源和成本的优势相当明显。Cran等、Seidel等用Y精子产下的公牛为90%，而用X精子则产下83%的母犊。而且Seidel等经过大量试验（使用1 370头青年母牛，22头公牛，进行11个试验）还发现:冷冻分离精子与新鲜分离精子授精后的怀孕率没有明显差异，分离冷冻精子授精剂量100万～150万个与300万个精子怀孕率没有差异，将冷冻的分离精子输入子宫角与输入子宫体的怀孕率没有差异。卢克焕的研究表明:用性别分离精子进行体外受精产生的胚胎，移植后产出表现正常的后代，而且性别决定准确率达到90%。据美国XY公司报道，奶牛性控冻精配种产母率在90%以上。10 787头青年母牛人工授精的受胎率为53%。据国内报道，产母率达到92%，受胎率达到49%～68%，平均达到50%以上。因此，从分离准确率及受胎率的影响考虑，性控冻精完全可以商业应用。

2.2 具有快速繁育的优势

按照传统的繁育方法，母牛的繁殖比例一般是每两年繁育一头母犊，而一头成年牛一生只能繁育3～4头母犊。而使用XY分离精液就可以打破传统的繁殖规律。据罗应荣等应用分离X精子冷冻精液对12头供体母牛进行输精，获得与未分离冷冻精液输精后相近的超排母牛采集胚胎的数量和质量。对采集到的61枚胚胎进行性别鉴定后，确定雌性胚胎的比例为100%，头均获得了可用胚胎5.5枚，11枚性控冷冻胚胎移植后，40 d以上的未返情率为63.6%。使用分选的X精子，结合人工授精技术就可以实现一头母牛每年产一头母犊，即一头母牛一生生产6～8头母犊。如果同时结合超数排卵技术与胚胎移植技术，生产体内性控胚胎，理论上它的效率将是超数排卵、性别鉴定和胚胎移植效率的一倍，而且可以省去性别鉴定的过程，从而降低成本，并且可以减少在性别鉴定中对胚胎造成的损伤，提高胚胎移植成功率。

2.3 具有加快种群改良的优势

在育种工作中，种公牛的选择强度远大于母牛的选择强度，如果采用目前市场上所用的人工授精方法，选择优质公牛精液，至少五代才能培育出优质、高产奶牛。而应用精子分选技术，在现有的条件下就可以加大母牛的选择强度，加快遗传进展，根据上述的扩增繁育方式，培育优良种群的时间将可缩短到3年以下。这将极大地提高育种工作效率。

3 性控冻精人工授精技术要点

性控精液经过XY精子的染色，多次筛选后对精子具有不同程度的损伤。性控冻精在制作时，分离时间延长，从采精到冷冻要比常规冻精时间长，因而精子的存活时间、受精能力会受到影响，比常规冻精受精能力稍低。Sartori等研究了用不同剂量的性控冷冻精液对超排青年母牛受精率和胚胎质量的影响，结果不同剂量的X冷冻精子（2×107个/支∶1×107个/支）获得可用胚胎数无明显差异，但明显低于常规精液的可用胚胎数。另外，使用X精子的青年母牛的受精率明显低于常规精液组。表明X精子经分离后受到一定程度的损伤，并影响超排青年母牛的受精率和胚胎的发育。因此性控冻精比常规冻精人工授精时间的把握要更加准确，技术要求更加严格，具体规程如下。

3.1 参配牛必须健康

要求无生殖系统疾病及其他疾病，营养均衡，体况适中，以青年牛为主，其次是健康经产牛。

3.2 输精时间更准确

根据奶牛的年龄、营养、体况、季节、发情持续期、卵泡发育程度掌握。排卵前3～5 h，发情结束后5～8 h，卵泡发育到有一触即破时为最佳输精时间。

3.3 输精位置更确切

一般输精位置在优势卵泡发育侧子宫角基部前2～3 cm处输精，如果确定不准就输在子宫体内，但不要输在子宫颈内3～5 cm处。

3.4 每个情期只输精一次

由于性控冻精价格较高，两次输精是一种浪费，同时也不利于适时输精的掌握。牛只排一个卵，适时一次输精完全可以找准精卵结合的最佳时间。配种后返情的牛，要仔细分析情况，检查是否有生殖疾病，如各种子宫炎症，并及时治疗，一般每头牛最多做两个情期输精，以后结合治疗再用常规冻精输精。

3.5 输精后发现炎症及时治疗

如果配种后发现有炎性分泌物，可以在输精后1～6 h宫注抗生素，以提高受胎率（注意抗奶的处理）。

3.6 结合促排卵保胎激素药物

可肌肉注射促排3号、绒毛膜促性腺激素、促黄体生成素等，促进卵泡成熟排卵，缩短输精后精卵结合时间。

3.7 做好配种记录

每次输精完毕，繁育员应详细填写配种繁殖记录，内容包括：母牛号、年龄、体况、胎次、发情时间、与配公牛号、输精时间、输精位置、产犊情况、繁育员签字等。记录详细，真实可靠。

3.8 技术水平和责任心

要求人工授精员有较高的现场实际操作经验，能通过外部观察及直肠检查准确判断发情牛所处的发情阶段，能判断卵巢上的优势卵泡，能掌握正确的输精部位且适时输精。能准确判断子宫炎症并及时治疗，会合理应用激素类药物。

4 性控精液存在的问题及应用前景展望

人们对性别控制精液在奶牛生产中的应用期盼已久，近年来荧光活性细胞的分类将该技术带到了商业应用的边缘。但两种限制因素依然存在，即分选的速度（可用性和价格）和受精率，还不能满足国内奶牛繁殖的需要。此外，性控精液的受孕率（含青年牛）约为35%～40%，而常规精液为55%～60%，限制了生产者应用性控精液的积极性。到目前为止，尚未发现流式细胞检索仪分离精子对DNA等有明显影响:Catt等研究发现，未见高浓度H33342和紫外线对DNA的内源性缺口有影响；Seidel等认为，染色与未染色精子在通过检索仪后在运动性和DNA完整性方面无差异，使用流式细胞检索仪进行精子性别分离后产下的后代没有明显的表型或基因型变化。但一些试验报道表明，使用性别分离精子比非分离者授精后怀孕率低，其原因还不很清楚。还有学者认为在精子分选过程中对精子细胞核的染色及紫外线的照射可能引起遗传学损伤，因有研究表明，紫外线照射可引起小鼠精子异常率增加，低浓度的Hoechst33342可使金黄地鼠产生突变。因此对于性控精液安全性还需进行深入研究。随着研究的深入和相关生物技术的不断发展，效果更稳定的性别控制技术将成为现实，从而推动我国畜牧业的前进。□