有氧运动训练对ApoE—/—小鼠肝脏铁调素蛋白和血清IL-6、MCP-1含量的影响

吴卫东

郑州大学体育学院（郑州 450044）

有氧运动训练对ApoE—/—小鼠肝脏铁调素蛋白和血清IL-6、MCP-1含量的影响

吴卫东

郑州大学体育学院（郑州 450044）

目的：观察有氧运动训练对载脂蛋白E基因缺陷（ApoE—/—）小鼠肝脏铁调素（Hepcidin）蛋白表达及血清IL-6、MCP-1水平的影响，探讨有氧运动防治ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化（AS）的作用。方法：20只8周龄雄性ApoE—/—小鼠随机分为对照组（C组，10只）和运动组（E组，10只），对照组小鼠不运动，运动组小鼠进行14周递增负荷跑台训练，每周5次，即小鼠由第1～5周10 m/min，30 min，逐渐递增至13 m/min，60 min，跑台坡度为0°。14周运动干预结束后取材，对小鼠主动脉进行包埋并进行冰冻切片，然后经苏木精-伊红（HE）和油红O（ORO）染色，观察主动脉的病理变化，采用Western blot方法检测肝脏Hep⁃cidin蛋白表达水平，同时采用双抗夹心酶联免疫（ABC-ELISA）方法检测血清Hepcidin、白细胞介素-6（IL-6）及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）含量。结果：对照组小鼠主动脉血管壁纤维板断裂，可见大量泡沫细胞浸润和纤维斑块，运动组小鼠较对照组主动脉病变减轻；运动组小鼠Hepcidin蛋白表达及血清水平显著低于对照组（P＜0.01）；运动组小鼠血清IL-6、MCP-1水平显著低于对照组（P＜0.01）。结论：长期有氧运动训练降低了ApoE—/—小鼠肝脏Hepcidin蛋白表达和血清水平，同时降低了小鼠血清中炎症因子IL-6、MCP-1的水平，从而发挥了防治ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化；运动；ApoE—/—小鼠；Hepcidin；IL-6；MCP-1

动脉粥样硬化（AS）是一种常见的动脉血管疾病，其所致的心、脑血管疾病发病率和死亡率均居各种疾病前列。有研究发现AS发生发展的重要机制之一是动脉粥样斑块内铁沉积的显著增多[1，2]。斑块内铁沉积一方面会导致巨噬细胞浸润和泡沫细胞出现[3]，另一方面可使血管内皮细胞脂质过氧化反应增强，促进巨噬细胞进一步浸润，不断放大氧化应激及炎症反应[4]，这是加速AS发生发展的重要因素。Hepcidin是一种主要在肝脏合成分泌的抗菌多肽，是一种负性铁调节激素，当机体铁缺乏时，Hepcidin表达减少使更多的铁进入血浆；当机体铁过多超过需要时，Hepcidin表达增加抑制小肠铁的吸收和单核巨噬细胞铁的释放，使更多的铁被限制在细胞内从而降低血浆中的铁含量[5]。Hepcidin过度表达可使AS斑块内铁沉积增多，巨噬细胞脂质积聚及炎症反应增强，导致AS斑块的不稳定性增加[6，7]。有氧运动是防治AS的有效手段，但关于有氧运动能否通过抑制肝脏Hepcidin蛋白的表达发挥防治AS的作用尚未见报道。本研究以载脂蛋白E基因缺陷（ApoE—/—）小鼠为动物模型，观察有氧运动对小鼠肝脏Hepcidin蛋白表达及对AS病变的影响，探讨有氧运动通过Hep⁃cidin防治AS的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及运动方案

20只8周龄雄性ApoE—/—小鼠以二级条件饲养，合格证号：scxk（京）2009-0007。适应性饲养1周后随机分为对照组（C组）和运动组（E组），每组10只，两组小鼠均饲以高脂膳食饲料（21%猪油，0.15%胆固醇，78.85%普通饲料）[8]。

对照组不运动，运动组小鼠于每日上午9～10时同时进行跑台运动，递增运动强度和时间，每周5次，即小鼠由第1～5周10 m/min，30 min，逐渐递增至13 m/min，60 min，跑台坡度为0°，稳定此运动量至14周末。此运动方案参考Bedford[9]等的研究确定，运动强度相当于75%最大摄氧量。

1.2 取材

14周运动干预结束后所有小鼠麻醉，内刺取血，制备血清。心脏血管在体经焦碳酸二乙酯（DEPC）水灌流后取出全心脏、主动脉及肝脏，DEPC水冲洗。取材前运动组小鼠停止运动48小时，禁食过夜。

1.3 测试指标和方法

主动脉病理观察：全心脏标本经4%多聚甲醛固定4小时，然后从心尖部切除一半心室，OCT包埋，沿心室部分进行连续冰冻切片，直至切到主动脉瓣。切片厚度10 μm进行连续切片，至主动脉瓣消失为止。从每只小鼠主动脉连续切片中每间隔10张取一张，共取10张进行HE及ORO染色，光镜下对组织切片随机选择3个视野进行观察。

血清Hepcidin、白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）含量测定：双抗夹心酶联免疫（ABC-ELISA）方法，实验步骤严格按试剂盒使用说明书操作。

肝脏Hepcidin蛋白测定：采用Western blot方法检测。取100 mg肝脏充分剪碎加入裂解液，匀浆后离心（14000 r/min，30 min）取上清液，测定蛋白浓度。调整上样量后，经SDS-PAGE电泳分离，用湿转法将目的蛋白转移至PVDF膜上。5%的脱脂奶粉封闭1小时，TBST洗涤后加一抗（1∶200）4oC过夜。TBST冲洗3次，加碱性磷酸酶标记的二抗（1∶3000）稀释液孵育1小时后显色，以肝脏Hepcidin与β-Actin的比值作为相对表达量。

1.4 主要试剂和仪器

台式高速低温离心机（AvantiTM30），美国BECK⁃MAN公司；BLATER冰冻切片机，ATTENPON公司；酶标仪，美国热电公司Multiskan MK 3；光学显微镜（AVNOX），OLYMPUS公司；电泳仪，北京六一仪器厂；ABC-ELISA试剂盒，美国R＆D公司；油红O染料，美国Sigma公司；β-Actin一抗，北京中山金桥生物技术有限公司；Hepcidin一抗，美国Abcam公司；二抗（山羊抗兔），北京中山金桥生物技术有限公司；PVDF膜 ，美国Millipore公司。

1.5 统计学分析

实验数据用平均数±标准差（±s）表示，用SPSS14.0数据软件包进行统计学分析，组间比较采用独立样本t检验。显著性水平P＜0.05。

2 结果

2.1 主动脉病理观察

对照组小鼠主动脉HE染色观察所见10例，发现大部分主动脉窦血管壁纤维板分裂成多层状、出现间隙，断裂严重，内膜失去原有的波浪状，且斑块内可见大量胆固醇结晶，显示出易损斑块的特征。运动组小鼠主动脉HE染色观察所见10例，发现大部分主动脉窦血管壁弹力纤维排列致密，偶有断层，内膜较完整，斑块内胆固醇结晶较少，见图1a、b。

对照组小鼠主动脉ORO染色观察所见10例，发现大部分主动脉窦血管腔可见大量被染成鲜红色的脂肪团块并占据部分管腔。运动组小鼠主动脉ORO染色观察所见10例，发现大部分主动脉窦血管腔内脂肪团块着色相对较浅，斑块脂质含量较少，只在贴近管壁内膜存在，血管腔的狭窄趋缓，见图1c、d。结果提示有氧运动有效延缓了ApoE—/—小鼠AS的发展。

图1 ApoE—/—小鼠主动脉窦横截面染色观察

2.2 血清IL-6、MCP-1含量

运动组小鼠血清IL-6、MCP-1水平显著低于对照组（P＜0.01），见表1。提示有氧运动可降低ApoE—/—小鼠血清IL-6、MCP-1水平。

表1 两组小鼠血清IL-6、MCP-1水平比较（n=10）

2.3 肝脏Hepcidin蛋白表达及血清含量

运动组小鼠肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平显著低于对照组（P＜0.01），见表2、图2。提示有氧运动可降低ApoE—/—小鼠肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平。

表2 两组小鼠肝脏Hepcidin蛋白表达及血清含量的比较（n=10）

图2 两组小鼠肝脏Hepcidin Western Blot蛋白表达

3 讨论

ApoE缺失会导致循环血液中胆固醇积累而诱发AS，ApoE—/—小鼠就是利用基因敲除技术，造成血液中胆固醇清除困难而不需要高脂饮食就会自发形成AS，且产生的AS斑块病变位置、病变过程与人类极为相似[10，11]。ApoE—/—小鼠AS模型是否成功建立主要依据主动脉病理形态学观察，本实验主动脉病理形态学观察发现对照组小鼠主动脉内膜明显增厚，内皮细胞下可见大量泡沫细胞聚集及粥样斑块，表明本实验AS模型成功建立，同时发现有氧运动可有效延缓ApoE—/—小鼠AS的发生发展。

3.1 有氧运动训练防治ApoE—//—小鼠AS过程中Hepci⁃din与IL-6、MCP-1的作用

AS是一种长期慢性炎症疾病，炎症细胞浸润是其重要特征。血管壁最初的炎症反应是通过炎症细胞增生保持机体内环境的稳定，从而实现对血管损伤的保护，但是血管壁炎症如不能及时消除则会对内皮组织和血管造成破坏，引发斑块破裂及血栓等并发症[12，13]。大量研究显示，炎症因子IL-6、MCP-1促进了AS的发生发展。IL-6可以诱导内皮细胞产生急性反应蛋白，增强对宿主自身的破坏性炎症，而且还可进一步激活主动脉TNF-α信号系统，从而形成正反馈的级联放大效应，使炎症反应加强[14]。MCP-1是AS炎症反应发生的重要因子，它在AS斑块巨噬细胞和平滑肌细胞内均有表达。MCP-1可以特异性趋化激活单核/巨噬细胞并使其进入血管内皮分化为巨噬细胞，然后通过大量摄取氧化型极低密度脂蛋白并聚集胆固醇，使巨噬细胞变为泡沫细胞[15]，这是AS发生发展的关键步骤。本研究发现，对照组小鼠肝脏Hepcidin蛋白的过度表达及高血清水平与血清炎症因子IL-6、MCP-1的高水平相一致，同时运动组小鼠的各项指标较对照组显著降低，提示Hepcidin可能通过促进斑块内的炎症反应加速了ApoE—/—小鼠AS病变的发展。

铁虽然是人体必需的元素，但其不成对电子可以催化生成氧自由基导致细胞损伤和脂质过氧化反应，因此铁的沉积成为促进AS发生发展的重要因素，有研究发现AS发生的初始阶段斑块内铁的浓度已经显著升高[16]。铁作为一种强氧化剂一方面可以促进内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞内低密度脂蛋白氧化生成具有强致AS作用的氧化型低密度脂蛋白，进而被组织巨噬细胞的清道夫受体识别并聚集大量脂质形成泡沫细胞；另一方面铁的沉积可以加速巨噬细胞凋亡并释放细胞内容物，使巨噬细胞进一步浸润从而不断放大炎症反应[17，18]。在Hepcidin的作用下大量铁沉积于AS斑块，导致斑块内的炎症反应增强并通过释放大量炎症因子如IL-6、MCP-1等加速AS的发生发展，这可能是Hepcidin促进AS发生发展的主要机制。过度表达的Hepcidin主要通过两个方面的作用使大量铁沉积于斑块内：（1）Hepcidin与小肠上皮细胞的膜铁转运蛋白1（Fp1）结合并促其降解，使小肠吸收的铁向血浆转运减少[19]，从而增加斑块内铁的沉积；（2）Hepcidin与巨噬细胞膜表面的Fp1结合促其内吞、降解，抑制巨噬细胞铁的释放[20]，从而促进斑块内巨噬细胞铁的沉积。由此可见，有氧运动可能通过降低小鼠肝脏Hepcidin蛋白表达和血清水平减少了AS斑块内铁的沉积，有效减弱了斑块内的炎症反应并降低了炎症因子IL-6、MCP-1的血清水平，从而延缓了AS的发生发展。

3.2 有氧运动训练在防治ApoE—//—小鼠AS过程中对肝脏Hepcidin蛋白表达的影响机制

本实验发现有氧运动抑制了小鼠肝脏Hepcidin蛋白的表达并降低了其血清水平，分析其机制可能有以下几方面：（1）有氧运动通过影响机体铁水平降低肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平。有研究发现机体铁负荷增加时Hepcidin表达增强，反之当机体铁缺乏时Hepcidin表达减弱[21]。机体内铁元素大约70%储存在红细胞，所以机体铁的需求量与红细胞水平密切相关。长期的有氧运动促使机体内红细胞生成增多，大量的铁释放入血浆，从而导致肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平降低；（2）有氧运动通过改善机体的长期慢性炎症状态降低肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平。研究发现炎症刺激可引起Hepcidin mRNA的过度表达[22，23]，炎症反应发生时肝脏Hepcidin mRNA的表达主要受IL-6调控，高水平的IL-6可诱导肝脏Hepcidin mRNA的过表达，Hepcidin的过表达反过来可进一步上调IL-6的表达水平，因此Hepcidin与IL-6之间可以相互作用，形成一个恶性循环。长期有氧运动可显著改善机体的慢性炎症状态，抑制机体IL-6的表达，打破Hepci⁃din与IL-6之间的恶性循环，从而抑制肝脏Hepcidin蛋白表达并降低其血清水平；（3）有氧运动通过影响弗林蛋白酶-铁调素调节蛋白信号系统降低肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平。主要在骨骼肌和心肌表达的铁调素调节蛋白（HJV）是一种重要的调节Hepcidin表达的蛋白，它主要有两种亚型，一是经弗林蛋白酶作用的分泌型sHJV，另一种是通过糖基磷脂酰肌醇锚合在细胞膜上的GPI-HJV。sHJV可以通过与GPI-HJV相互竞争阻断骨形态发生蛋白信号通路的传导从而抑制Hepcidin蛋白的表达[24，25]。有氧运动可使弗林蛋白酶的表达水平提高，高水平的弗林蛋白酶会使sHJV产生增多，同时增加GPI-HJV的脱落，因此，有氧运动可能通过此信号通路直接降低肝脏Hepcidin蛋白表达及血清水平。

4 结论

长期有氧运动训练降低了ApoE—/—小鼠肝脏Hep⁃cidin蛋白表达和血清水平，同时降低了小鼠血清中炎症因子IL-6、MCP-1的水平，从而发挥了防治ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化的作用。

[1]Ricardo L，Stefan A，Ahmed T，et al.Atherosclerosis:Re⁃cent trials，new targets and future directions[J].Int J Car⁃diol，2015，192（10）:72-81．

[2]Galesloot TE，Janss LL，Burgess S，et al.Iron and hepci⁃din as risk factors in atherosclerosis:what do the genes say?[J]Bmc Genetics，2015，16（1）:1-12.

[3]Sharkey-Toppen TP，Tewari AK，Raman SV，et al.Iron and atherosclerosis:nailing down a novel target with mag⁃netic resonance[J].J Cardiovasc Transl Res，2014，7（5）:533-542.

[4]Winner WM，Sharkey-Toppen T，Zhang X，et al.Iron and noncontrast magnetic resonance T2 as a marker of intra⁃plaque iron in human atherosclerosis[J].J Vasc Surg，2014，61（6）:1556-1564.

[5]Ruchala P，Nemeth E.The pathophysiology and pharma⁃cology of hepcidin[J].Thends Pharmacol Sci，2014，35（3）:155-161．

[6]Mascitelli L，Pezzetta F，Sullivan JL.Iron，hepcidin，and in⁃creased atherosclerosis in systemic lupus erythematosus[J].Int J Cardiol，2008，131（1）:20-21.

[7]Li H，Feng SJ，SU LL，et al.Serum hepcidin predicts ure⁃micaccelerated atherosclerosisin chronic hemodialysis patients with diabetic nephropathy[J].Chinese Med J，2015，128（10）:1351-1357.

[8]Zhang SH，Reddick RL，Piedrahita JA，et al.Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E[J].Sci，1992，258（5081）:468-471.

[9]Bedford TG，Tipton CM，Wilson NC，et al.Maximum oxy⁃gen consumption of rats and its changes with various ex⁃perimentalprocedures[J].JApplPhysiolRespirEnviron Exerc Physiol，1979，47（6）:1278-1283.

[10]Reddick RL，ZhangSH，MaedaN.Atherosclerosisin mice lacking apo E Evaluation of lesional development and progression[J].Arterioscl Throm Vas，1994，14（1）:141-147.

[11]Nakashima Y，Plump AS，Raines EW，et al.ApoE-defi⁃cient mice develop lesions of all phases of atherosclero⁃sis throughout the arterial tree[J].Arterioscl Throm Vas，1994，14（1）:133-140.

[12]Razi K，Vincent S，Jean-Claude T，et al.Novel anti-in⁃flammatory therapies for the treatment of atherosclerosis.Atherosclerosis，2015，240（2）:497-509.

[13]Hueng-Chuen F，Carlos FH，Jenn-Haung L.Protein ki⁃nase C isoforms in atherosclerosis:Pro-or anti-inflammato⁃ry?[J]Biochem Pharmacol，2014，88（2）:139-149.

[14]Pavlidis TE.Cellular changes in association with defense mechanismsin intra-abdominalsepsis[J].Minerva Chir，2003，58（6）:777-781.

[15]Xu YK，Ke Y，Wang B，et al.The role of MCP-1-CCR2 ligand-receptor axis in chondrocyte degradation and dis⁃ease progress in knee osteoarthritis[J].Biol Res，2015，48（64）:155-163.

[16]Raman SV，Sharkey-Toppen TP，Tran T，et al.Iron，inflam⁃mation and atherosclerosis risk in men VS perimenopaus⁃al women[J].Atherosclerosis，2015，241（1）:249-254.

[17]Vucevic D，Radosavljevic T，Mladenovic D，et al.Iron as an agent of oxidative injury in experimental atherosclero⁃sis[J].Acta Vet Hung，2011，61（5）:631-641.

[18]Anwar M，Abdelhalim K.Atherosclerosis can be strongly influenced by iron and zinc overlosd or deficiency in the lung and kidney tissues of rabbits[J].Afr J Microbiol Res，2010，4（4）:2748-2753.

[19]Nemeth E，Ganz T.Hepcidin and iron-loading anemias[J].Haematologica，2006，91（6）:727-732.

[20]Ganz T.Hepcidin and iron regulation，10 years later[J].Blood，2011，117（17）:4425-4433.

[21]MR Jr.Hepcidin and iron regulation in health and dis⁃ease[J].American Journal of the Medical Sciences，2013，345（1）:57-60.

[22]Zhang X，Rovin BH.Beyond anemia:hepcidin，monocytes and inflammation[J].Biol Chem，2013，394（2）:231-238.

[23]Sihler KC，Raghavendran K，westerman M，et al.Hepcidin in trauma:linking injury，inflammation，and anemia[J].J Trauma，2010，69（4）:831-837.

[24]Silvestri L，Pagani A，Camaschella C.Furin-medisted re⁃lease of soluble hem ojuvelin:a new link between hypox⁃ia and iron homeostasis[J].Blood，2008，111（2）:924-931.

[25]Babitt JL，Huangm FW，Xia Y，et al.Modulation of bone morphogenetic protein signaling in vivo regulates system⁃ic iron balance[J].J Clin Invest，2007，117（7）:1933-1939.

Effects of Aerobic Exercise on the Expression of Hepatic Hepcidin，and the Level of Serum IL-6 and MCP-1 in ApoE—/—Mice

Wu Weidong
Physical Education College of Zhengzhou University，Zhengzhou 450044，China Corresponding Author:Wu Weidong，Email:hwwd81@sina.com

ObjectiveTo observe the preventive effects of the aerobic exercise on the expression of hepatic hepcidin，and the level of serum IL-6 and MCP-1 in ApoE—/—rats with atherosclerosis（AS）and to explore the mechanism.MethodsTwenty 8-week male ApoE—/—mice were randomly divided in⁃to a control group and an exercise group，each of 10.The AS model was established in both groups through feeding high-fat diet.The control group was not given exercise intervention，while the exercise group underwent 14-week progressive intensity treadmill training，5 times a week，starting at 10 m/min for 30 min for the first 5 weeks and increasing to 13 m/min for 60 min at the end.At the end of the experiment，aortic samples were fixed and treated using the hematoxylin-eosin staining and Oil Red O.Then the pathological changes of the aorta were analyzed.The hepcidin expression of liver and se⁃rum hepcidin was assessed using Western blotting，and the level of the，interleukelin-6 （IL-6） and monocyte chemotactic protein-1（MCP-1） were detected using ABC-ELISA.ResultsThe pathological slice showed that the vascular fiber plate and internal membrane of the aorta in the exercise group were better than that of the control group，with less ruptured vascular fibreboards，foam cell infiltrationand fiber plaques.The hepcidin expression of liver and the level of serum hepcidin，the level of the se⁃rum IL-6 and MCP-1 in the exercise group were significantly lower than those of the control group（P＜0.01 andP＜0.01）.ConclusionThe long-term aerobic exercise can prevent AS for ApoE—/—mice through lowering the expression of the hepatic hepcidin and serum hepcidin，as well as the level of se⁃rum IL-6 and MCP-1.

atherosclerosis，exercise，ApoE—/—mice，hepcidin，IL-6，MCP-1

2016.12.25

河南省高等学校重点科研项目计划（15B890006）；郑州大学体育学院院管科研项目计划（2015C3007）

吴卫东，Email：hwwd81@sina.com