4周间歇性禁食对大鼠骨骼肌质量及自噬的影响

王祯 于亮 史霄雨

北京体育大学运动人体科学学院（北京 100084）

4周间歇性禁食对大鼠骨骼肌质量及自噬的影响

王祯 于亮 史霄雨

北京体育大学运动人体科学学院（北京 100084）

目的：探讨4周间歇性禁食后大鼠体重、体脂及骨骼肌质量的变化与大鼠骨骼肌自噬的关系，为间歇性禁食提供理论依据。方法：20只雄性SD大鼠随机分为对照组（Con组）和间歇性禁食组（IF组），每组各10只。采取每周三、周五间歇性禁食方案，每周按时记录大鼠体重，4周干预后双能X线吸收测量法（DEXA）分析体脂含量，之后分离双侧比目鱼肌称量湿重，免疫荧光法检测比目鱼肌laminin蛋白体现肌肉横截面积，透射电镜观察比目鱼肌自噬泡形态，Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、p62及调控蛋白AMPKα、p-AMPKα、ULK1的表达情况。结果：4周间歇性禁食后，间歇性禁食组大鼠体重与体脂含量显著低于对照组（P＜0.01），但各组比目鱼肌湿重及肌纤维横截面积并无明显差异（P＞0.05）。间歇性禁食组比目鱼肌AMPKα、p-AMPKα、ULK1蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.01），间歇性禁食组比目鱼肌内自噬标记LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平明显高于对照组，p62表达水平明显低于对照组，均具有非常显著性差异（P＜0.01）。结论：4周间歇性禁食明显降低体脂水平，具有控制体重的作用，可激活AMPK-ULK1通路适度促进骨骼肌自噬，以维持骨骼肌质量，可作为一种潜在的“减肥”方法进行深入研究。

间歇性禁食；骨骼肌质量；自噬；AMPK；LC3

间歇性禁食（intermittent fasting，IF）是指机体周期性的保持禁食与摄食交替进行，其中禁食日摄入热量极低或为零的一种方法。有研究表明，实验动物在禁食期间心血管系统疾病和糖尿病的风险降低，体内脂肪的供能比例增加，可在减脂的同时改善炎症、神经退行性疾病、代谢综合征等多种疾病程度，具有抗衰老、改善健康的作用[1-3]。但间歇性禁食在控制能量摄入的同时，可能降低体内糖和蛋白质水平，进而影响骨骼肌质量[4，5]。现已证实骨骼肌自噬是利用溶酶体清除受损蛋白质和细胞器，实现蛋白质合成与降解的平衡，保持机体稳态的重要过程，自噬水平适度增加有助于维持骨骼肌质量与功能[6]。本研究通过建立4周间歇性禁食模型，明确间歇性禁食对大鼠脂肪及骨骼肌质量的影响，观察骨骼肌自噬在间歇性禁食过程中对骨骼肌质量的影响，为间歇性禁食的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

20只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重300±20 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，于北京体育大学SPF级动物实验室饲养，相对湿度50%～70%，温度20～24℃，昼夜明暗交替各12小时。所有动物预适应3天后开始实验，随机分为2组对照组（Con组）和间歇性禁食组（IF组），每组10只。对照组大鼠体重296.1±14.33 g，间歇性禁食组体重293±17.63 g，两组大鼠体重经独立样本t检验无显著性差异（P＞0.05）。实验期间每周六下午称量大鼠体重，记录大鼠体重变化情况。

1.2 主要试剂及仪器

AMPKα抗体，ab80039，Abcam公司；p-AMPKα抗体，ab133448，Abcam公司；ULK1抗体，ab128859，Ab⁃cam公司；LC3抗体，ab128025，Abcam公司；p62抗体，ab56416，Abcam公司；laminin抗体，ab11575，Abcam公司；GAPDH抗体，TA-08，北京中杉金桥生物技术有限公司；磷酸酶抑制剂，Roche公司；蛋白酶抑制剂，Roche公司。

Western Blotting电泳仪、电转仪，Bio-Rad公司；xMark酶标仪，Bio-Rad公司；防脱磨砂载玻片，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 间歇性禁食模型

研究过程中常使用的三种禁食方式为能量摄入限制、隔日禁食和饮食限制。在参照Vasconcelos等[7]设计的大鼠隔日禁食方案的基础上，考虑“人性化”因素在研究过程中减少禁食时间，降低禁食“强度”，在Brown等[8]提出的间歇性禁食模型上进行修改完成本研究间歇性禁食模型。具体干预方案为间歇性禁食组大鼠单笼饲养，预适应期间每天称量投食量及次日食物剩余量，并计算该组大鼠正常进食量，以周为单位，正式实验期间每周三、周五食物完全剥夺24 h，禁食期间饮水自由，每周四、周六根据计算给予大鼠正常进食量，总热量与周一、周二、周日相同。达到周二至周六进行禁食与否的交替操作，周一和周日正常饮食进行调整的效果。实验周期为4周。以上禁食、称量均在每天同一时间点进行。

图1 本研究间歇性禁食模型示意图

1.4 取材及检测指标

1.4.1 取材

4周实验后，各组处死前禁食12小时，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，按3 mg/kg体重进行腹腔注射，腹主动脉取血致死。取双侧比目鱼肌，放于锡纸上，分别称量左右腿湿重；分割米粒大小用OCT冰冻切片包埋剂包埋后放入－80℃冰箱，做冰冻切片使用；同样分割米粒大小放入戊二醛中，做电镜使用；剩余比目鱼肌投入液氮，随后转移至－80℃超低温冰箱冷冻保存用于检测相关蛋白的表达。除称重外，其余实验过程不区分左右腿。

1.4.2 双能 XX线吸收测量法（DEXA）

取材前开机校准仪器，打开NORLAND软件，将麻醉的大鼠放于扫描床上，依次标定开始点、结束点、基点，开始扫描，扫描结束后保存、分析数据，以记录大鼠体脂含量，每组测量3只。

1.4.3 免疫荧光检测laminin

细胞外层粘连蛋白laminin位于细胞外基质，是基膜的特有成分和主要功能成分。通过检测其定位，可以反映骨骼肌横截面积。实验前提前开启冰冻切片机预冷，将温度调至－20℃。将从－80℃取出的包埋块放置在冰冻切片机中平衡温度20分钟。清理冰冻切片机内部，用OCT冰冻切片包埋剂浇铸固定组织的底座，固定玻璃盖板及刀片，待OCT凝固后将上端削平，继续在底座上滴加少许冰冻切片包埋剂，从包埋壳中取出组织，并垂直固定在底座上，凝固后修整，以便切横截面。常温放置防脱载玻片。先用50 μm 粗调，后用8 μm细调调整组织与刀片间距离。待距离合适后切下组织并固定在防脱载玻片上。显微镜下观察肌细胞形态、结构，－80℃保存。

选取在－80℃保存带有样本的防脱载玻片，PBS摇床洗3次，每次15分钟，用含有0.3%Triton的PBS摇床破膜30分钟，5% 羊血清室温封闭30分钟，一抗lam⁃inin浓度1：500，滴加后湿盒内4℃ 过夜，次日加入荧光二抗（避光操作，浓度1:500），DAPI封片后，激光共聚焦显微镜100倍拍摄laminin储存，每组选取3只，每只拍摄8张，使用Image-Pro Plus软件统计横截面积大小。

1.4.4 透射电镜检测自噬体形态

将固定并置于戊二醛中于4℃保存的标本按照以下步骤进行操作：（1）0.1 M磷酸缓冲液浸洗30 min。（2）1%四氧化锇固定液（固定液内含有磷酸缓冲液）4℃固定2小时。（3）0.1 M磷酸缓冲液浸洗10 min。（4）乙醇梯度脱水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇各10 min。（5）70%乙醇醋酸双氧铀块染2小时或过夜。（6）90%乙醇10 min×2；100%乙醇10 min×3。（7）环氧丙烷置换10 min。（8）环氧树脂EMbed浸透、包埋、聚合。（9）作1～2 μm的半超薄切片，美兰染色后光学显微镜下定位，超薄切片机制作60 μm的超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，透射电镜下观察、拍照。每组2只，每只2个标本，分别选取1000、3000、6000倍三个视野进行拍摄。观察比目鱼肌自噬体形态变化。

1.4.5 Western Blot

选取在－80℃保存的比目鱼肌100 mg于EP管中剪碎，加入1 ml含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RAPI裂解液，冰浴匀浆30秒。静置30分钟后，4℃、12000 rpm离心8分钟，取上清。使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，之后加入相应比例的裂解液和5×loading buffer，将浓度调为一致，100℃变性10分钟，冷却后－40℃冷冻备用。

Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、p62及调控蛋白AMPKα、p-AMPKα、ULK1的表达。AMPKα、p-AMPKα、ULK1、p62采用10%分离胶浓度，LC3采用12%分离胶浓度，进行SDS-PAGE凝胶电泳，300 mA转膜1.5小时，5%BSA对PVDF膜封闭2小时，使用5%BSA配制一抗AMPKα（浓度1∶500）、p-AMPKα（浓度1∶500）、ULK1（浓度1∶500）、LC3（浓度1∶500）、p62（浓度1∶500）、GAPDH（浓度1∶2000），4℃过夜。目的蛋白二抗浓度1∶1000，内参二抗浓度1∶2000，室温摇床孵育1.5小时，洗膜后进行曝光显影，利用Image Lab5.1软件进行灰度值分析。

1.5 数据统计与分析

所有实验数据采用平均数±标准差（±s）表示，使用Image J、spss19.0、GraphPad Prism等软件进行分析处理，组间分析采用单因素方差分析的LSD法，具有统计学意义的标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 间歇性禁食后大鼠体重、体脂的变化

4周实验后，对照组与间歇性禁食组大鼠体重均明显高于实验前，差异有统计学意义（P＜0.01）。对照组体重每周增幅明显，与实验前对比差异有统计学意义（P＜0.01），间歇性禁食组从第二周开始，每周体重同样逐渐升高，与实验前对比差异有统计学意义（P＜0.01）；两组相比，对照组大鼠体重增长幅度更大，从第二周开始，对照组体重明显高于间歇性禁食组（P＜0.01）。见表1。

表1 大鼠体重增长趋势

在4周干预后对大鼠进行麻醉，DEXA扫描测量其体脂含量（图2），发现间歇性禁食组大鼠体脂含量（44.93 ± 3.59 g）明显低于对照组（60 ± 1.67 g），差异有统计学意义（P＜0.01）。

图2 DEXA检测大鼠体脂含量

2.2 间歇性禁食对大鼠比目鱼肌湿重及肌纤维横截面积的影响

4周干预后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌湿重与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。本研究对大鼠比目鱼肌进行冰冻切片，免疫荧光检测laminin，发现4周间歇性禁食干预后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌纤维横截面积变化不大，与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

表2 大鼠比目鱼肌湿重

图3 大鼠比目鱼肌纤维横截面积

2.3 间歇性禁食对大鼠比目鱼肌自噬体形态的影响

本研究使用透射电镜定性分析间歇性禁食后骨骼肌内自噬体形态的变化，发现与对照组相比，间歇性禁食组比目鱼肌中双层“脂质体”膜结构增加，胞浆中包括细胞器在内的双层膜结构增多，见图4。

图4 透射电镜检测大鼠比目鱼肌自噬体形态

2.4 间歇性禁食对大鼠比目鱼肌自噬相关蛋白的影响

2.4.1 比目鱼肌AMPK α、p-AMPK α蛋白表达变化

4周实验后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌内AMPKα、p-AMPKα的表达均明显高于对照组（P＜0.01），表明间歇性禁食过程中能量摄入减少可能激活了能量开关AMPK。见图5。

图5 大鼠比目鱼肌内AMPKα、p-AMPKα蛋白表达

2.4.2 比目鱼肌ULK 1蛋白表达变化

ULK1是AMPK通路调控自噬的下游信号。4周实验后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌ULK1蛋白表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图6。

2.4.3 比目鱼肌LC 3、 p62蛋白表达变化

经过4周实验后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌内LC3-Ⅰ蛋白水平显著高于对照组（P＜0.05），而LC3-Ⅱ蛋白表达水平非常显著地高于对照组（P＜0.01），间歇性禁食组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明显高于对照组（P＜0.01）。此外，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌中的p62在4周间歇性禁食后明显低于对照组（P＜0.01），见图7。

图6 大鼠比目鱼肌内ULK1蛋白表达

图7 大鼠比目鱼肌内LC3、p62蛋白表达

3 讨论

3.1 间歇性禁食对大鼠体重的控制情况

禁食是一种控制机体能量摄入的方法，在研究过程中通常使用的三种禁食方案为能量摄入限制（calor⁃ic restriction，CR）、隔日禁食（alternate-day fasting，ADF）和饮食限制（dietary restriction，DR）[9]。间歇性禁食（intermittent fasting，IF）是在欧美地区日益流行的新兴减肥手段，是指周期性地在一定的时间内保持零热量或极低热量摄入，禁食期间保证正常饮水的方法。由于其禁食和摄食呈周期性规律，因此在保证周期性的前提下可调整间歇性禁食的时间，隔日禁食也属于间歇性禁食。目前，间歇性禁食作为一种潜在的非药理学干预手段，已被证明可以增进健康，延缓衰老。机体在间歇性禁食过程中，由于能量收支平衡遭到破坏，会动用脂肪供能，对加速脂肪分解、减少体内脂肪含量、降低体重起到积极作用。研究发现间歇性禁食可显著减少肥胖者体重[10]以及BMI[11]。但可能存在的问题是在热量摄取没有调整的情况下，由于间歇性禁食后静息能量支出的减少，可能使禁食期间体重增加[12]。

本研究在参照Vasconcelos等设计的大鼠隔日禁食方案的基础上，以减少禁食时间，降低禁食“强度”为原则，修改Brown等提出的间歇性禁食模型，建立每周三、周五食物完全剥夺，周二至周六进行禁食与否的交替操作的间歇性禁食模型，这样在影响AMPK表达后，可通过周一和周日正常饮食进行调整，以达到研究“低强度”间歇性禁食的目的。结果在进行4周实验后，间歇性禁食组大鼠体重及体脂含量明显低于对照组（P＜0.01），这表明本实验间歇性禁食方案对于控制体重、降低体脂含量具有较为明显的效果。实验过程中课题组每周保证对照组和间歇性禁食组大鼠的食物总量相等，但在实际喂养中发现大鼠在非禁食日，尤其是每周日和下周一并未将食物全部摄入。这就无法解释研究结果是由空腹还是能量摄入减少引起的，分析原因可能是禁食强度不够，下一步进行隔日禁食再观察上述情况。无论是空腹还是能量摄入减少均可以启动“能量开关”AMPK。作为细胞内的能量感受器，AMPK的激活主要由磷酸化完成，并调节包括骨骼肌组织在内的机体多条下游靶向通路，在调节糖代谢和脂代谢过程中发挥重要作用。运动可促使机体能量消耗，增加AMP/ATP比值，激活AMPK已得到公认，同样能够改变机体能量水平的禁食也可促进大鼠骨骼肌AMPK磷酸化水平[13]，并且在激活AMPK时引发糖代谢和脂代谢的基因转录调控[14]。Wijngaarden等[15]研究发现，在能量摄入限制过程中AMPK被激活的同时，受试者体内脂肪酸的利用率明显增加。本实验研究发现在经过4周间歇性禁食后，大鼠比目鱼肌内AMPKα及p-AMPKα蛋白表达显著升高（P＜0.01），表明本实验设计的间歇性禁食方案能够改变AMPK水平调控糖脂代谢，进而影响体脂含量和体重。

3.2 间歇性禁食诱导的自噬对大鼠骨骼肌质量的影响

目前关于禁食对骨骼肌质量方面的影响研究尚少且存在争议，有研究发现热量限制能减少衰老导致的肌肉质量的丢失[16]，增强肌肉的收缩能力[17]。但也有学者发现长期的热量限制会显著减少大鼠骨骼肌蛋白质含量[18]，降低肌肉质量[19]。本研究从比目鱼肌湿重和肌纤维横截面积入手，发现在4周间歇性禁食后并未发生显著性差异，提示该间歇性禁食方式没有造成大鼠比目鱼肌骨骼肌质量下降，可能与激活AMPK通路诱导适度自噬有关。

生命体借自噬维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定，净化自身多余或受损细胞器，自噬体的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解，自噬溶酶体内分解出的其他成分可被细胞再利用。这一过程在细胞废物清除、结构重建、新陈代谢中起重要作用。自噬可被饥饿、缺血缺氧、细胞重建等多种应激条件激活，其自噬标志蛋白LC3表达会发生变化。在自噬体吞噬细胞组分时，胞浆内LC3-Ⅰ会与磷脂酰乙醇胺结合，转变为LC3-Ⅱ，通常使用LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平反映自噬活性。但自噬水平无论是过度还是不足，都会对骨骼肌质量产生不利影响。前者在大鼠尾悬吊的研究中已经得到证实，会促使骨骼肌萎缩[20]；后者则不能及时清除受损的细胞器，导致骨骼肌凋亡甚至坏死发生[21]。

AMPK分为α、β和γ三种亚单位，其中α分为α1和α 2，β分为β1和β2，γ分为γ1、γ2和γ3等不同亚型。AMPK具有多个磷酸化位点，p-AMPK-Thr172是AMPK被激活所发生磷酸化的位点之一，其磷酸化水平受高浓度ATP引起的上游激酶磷酸化和蛋白质磷酸酶抑制去磷酸作用，共同诱导AMP进行精确底物调节，而且细胞内AMP和ATP浓度变化可影响上述调节过程[22]。营养水平、运动程度、药物干预等因素均可诱导自噬，而且自噬水平的增加可能与促进健康甚至延长寿命有关[23-25]。禁食过程中能量消耗可改变AMP/ATP比例，激活AMPK强烈诱导自噬发生，有研究表明自噬可以促进营养缺乏时细胞的存活，其通过细胞质成分的“自我消化”，在有限的能源中回收所有的营养成分，实现蛋白质合成和蛋白质降解之间的平衡，维持细胞稳态[26，27]。也有学者发现长期禁食可上调自噬关键基因的转录，增加骨骼肌中的BECN1和LC3蛋白水平，提示自噬可以从细胞中去除功能失调的细胞器和受损蛋白质，进而减少炎症，改善代谢稳态[28]。

本研究发现4周实验后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌自噬标志分子LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平明显高于对照组（P＜0.01），p62明显低于对照组（P＜0.01），提示间歇性禁食可能通过激活AMPK，诱导骨骼肌自噬。在调控过程中AMPK可以通过TSC1/2抑制mTORC1、通过JNK抑制BCL2、通过促进FoxO3激活自噬，但最直接的途径为磷酸化ULK1激活自噬[29-31]。AMPK可通过在Ser317、Ser777、Ser467、Ser555等多个位点磷酸化ULK1，mTORC1也可以在Ser317、Ser777位点磷酸化ULK1并产生抑制作用，AMPK激活可在Ser757磷酸化ULK1抑制mTORC1[32]。本研究发现4周实验后，间歇性禁食组大鼠比目鱼肌ULK1表达水平明显高于对照组（P＜0.01），说明本实验间歇性禁食模型激活AMPK后可能是通过促进ULK1激活骨骼肌自噬。自噬的迅速激活对于快速清除对机体造成危害或处于堆积状态的蛋白和细胞器，保证骨骼肌正常生理状态具有重要意义。尽管有报道指出，禁食在增加自噬的同时导致肌肉萎缩发生，但从长期来看适度的自噬可以清除失活线粒体和聚集的肌纤维，防止肌细胞死亡[33]。Bujak等研究发现禁食期间的骨骼肌AMPK敲除鼠会出现自噬停止现象，从而影响肌肉功能和线粒体活动[34]。这说明在能量不足的情况下，细胞通过增强自噬活性也是作为细胞能量缺乏的一种补充。由于线粒体功能紊乱可导致骨骼肌萎缩，运动可以通过线粒体生物合成和线粒体自噬提高线粒体功能和骨骼肌机能[35]。因此，我们推测间歇性禁食在机体能量水平下降的状态下激活AMPK诱导的适度自噬，可以清除骨骼肌内堆积的蛋白或细胞器，从而保证骨骼肌质量。

4 小结

本实验研究发现，4周间歇性禁食可以有效降低大鼠体脂含量，起到控制体重的作用，且不会导致骨骼肌质量下降，其原因可能与AMPKα磷酸化激活下游ULK1，诱导适度骨骼肌自噬，增强骨骼肌适应有关。建议从骨骼肌线粒体等细胞器的角度，研究长期间歇性禁食或不同强度的间歇性禁食作用，系统阐明作用机制，为进一步明确该方法的“减肥”效果奠定基础。

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Effects of Four-week Intermittent Fasting on Skeletal Muscle Mass and Autophagy in Rats

Wang Zhen，Yu Liang，Shi Xiaoyu
Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China Corresponding Author:Yu Liang，Email：yuliang@bsu.edu.cn

ObjectiveTo observe the changes of body weight，fat mass and skeletal muscle mass of rats after 4 weeks of intermittent fasting，and explore relationship with autophagy in skeletal muscle，so as to provide theoretical basis for intermittent fasting.MethodTwenty male Sprague Dawley rats were randomly divided into a control group（Con）and an intermittent fasting group（IF），each of 10.The rats of IF group were forbidden to eat food every Wednesday and Friday，and the body weight of both groups was recorded weekly.After 4 weeks，Dual-Energy X-Ray Absorption（DEXA）was used to ana⁃lyze the body fat mass，then the bilateral soleus was separated to record the wet weight and measure the cross-sectional area of the soleus fibers by testing laminin with immunofluorescence confocal laser scanning microscope.The form of autophagic vacuole of soleus was observed using a transmission elec⁃tron microscopy.The expression of autophagy-related protein LC3，p62 and regulating protein AMPK，p-AMPK and ULK1 were measured using Western blotting.ResultAfter 4 weeks of intermittent fasting，the weight and fat mass of IF were significantly lower than those of Con （P＜0.01），but there were no significant differences between them in wet weight and cross-sectional area of soleus（P＞0.05）.The ex⁃pressions of AMPK，p-AMPK，ULK1 in IF were significantly higher than those in Con（P＜0.01）.Com⁃pared with Con，the expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰof IF increased significantly，while the expression ofp62 decreased significantly（P＜0.01）.ConclusionFour weeks of intermittent fasting decreases the fat mass significantly，and control the weight efficiently.Intermittent fasting can maintain the skeletal mus⁃cle mass by promoting moderate autophagy through the AMPK-ULK1 pathway.It should be a potential“lose weight”method for further research.

intermittent fasting，skeletal muscle mass，autophagy，AMPK，LC3

2017.02.04

国家自然科学基金（31500964），霍英东教育基金会资助（151095），国家体育总局全民健身课题（2015B046），中央高校基本科研业务费专项资金资助，北京体育大学自主科研课题（2016RB018，2017YB028）

第1作者：王祯，Email：434436884@qq.com；

于亮，E-mail：yuliang@bsu.edu.cn