人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在不典型鳞状细胞患者中的临床应用

张月辉 潘嫱微 吕杰强⋆ 郑园园 童郁

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在不典型鳞状细胞患者中的临床应用

张月辉 潘嫱微 吕杰强⋆ 郑园园 童郁

目的 探讨人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA检测在无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ASC-US）患者中的临床应用价值。方法 对320例ASC-US患者进行HPV E6/E7mRNA和高危型HPV（HR-HPV）DNA检测，结合病理学诊断资料进行统计学分析。结果 CINⅡ+级和CINⅢ+级的HPV E6/E7mRNA阳性率分别高于CINⅡ-级和CINⅢ-级，差异均有统计学意义（P＜0.001）；不同等级宫颈病变的HPV E6/ E7mRNA拷贝数不同，差异有统计学意义（P＜0.001），且宫颈病变级别与mRNA拷贝数之间呈正相关。HPV E6/E7mRNA与HR-HPV DNA检测CINⅡ+级和CINⅢ+级的灵敏度、阳性预测值、阴性预测值差异均无统计学意义（P＞0.05）；两者特异度比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。结论 HPV E6/E7mRNA检测作为ASC-US的分流指标更确切有效，是目前ASC-US患者是否阴道镜转诊的较佳分流策略。

E6/E7mRNA 人乳头瘤病毒 无明确诊断意义的不典型鳞状细胞

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，HPV感染是宫颈癌发生的主要危险因素。99.7%的宫颈癌细胞中可以检测到高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）［1］。如何及早筛查和预防宫颈癌尤为重要。液基薄层细胞学检查（TCT）是一种较先进的宫颈细胞学检查技术，其中无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（ASC-US）是最常见的宫颈细胞学异常结果［2］，同时存在宫颈癌前病变，甚至宫颈癌的可能。如何对ASC-US患者进行分流处理一直是宫颈病变诊治中存在的难点和争论点。本研究对ASC-US患者同时检测HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA，并行阴道镜检查和宫颈活检，以探讨HPV E6/E7mRNA检测在ASC-US患者中的临床应用价值。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2013年10月至2015年4月在温州市人民医院妇科门诊就诊，TCT结果为ASC-US的患者320例，年龄21～65岁，中位年龄37岁，均无宫颈上皮内瘤变（CIN）史﹑盆腔放射治疗史﹑子宫切除史，排除妊娠，取材前3d内无性生活史。

1.2 方法 （1）TCT检测：宫颈刷插入宫颈外口旋转5周，采集宫颈表面及宫颈管内脱落细胞，将细胞洗脱在新柏氏膜式液基液中，用TCT专用制片机制成薄层涂片，经巴氏染色后镜检。显微镜下观察分析脱落细胞形态，按照2001年TBS系统标准诊断为ASCUS。将剩余标本置于8℃～25℃保存。（2）HPVE6/ E7mRNA检测：采用TCT剩余标本，Quantivirus法支链DNA杂交捕获原理定量检测14种HR-HPV（16﹑18﹑31﹑33﹑35﹑39﹑45﹑51﹑52﹑56﹑58﹑59﹑66和68）E6/E7mRNA的表达，试剂盒购自河南中美合资科蒂亚生物技术有限公司，结果经电脑软件换算为拷贝数，以拷贝数≥1copy/ml为阳性。（3）HPV DNA检测：采用DNA导流杂交基因芯片技术，使用HPV分型基因芯片检测系统（上海凯普生物化学有限公司），检测21种HPV亚型，其中13种高危亚型（16﹑18﹑31﹑33﹑35﹑39﹑45﹑51﹑52﹑56﹑58﹑59和68），1种HR-HPV阳性即为阳性。（4）阴道镜检查及宫颈活检：由本院阴道镜专科医师对本组患者行阴道镜检查，并对可疑病灶进行定位活检，未见明显异常者行宫颈3﹑6﹑9﹑12点常规活检和宫颈管搔刮。根据病理检查结果分为正常/炎症﹑CINⅠ级﹑CINⅡ级﹑CINⅢ级﹑宫颈癌。以病理诊断为金标准，以CINⅡ+级（包括CINⅡ级﹑CINⅢ级和宫颈癌）和CINⅢ+级（包括CINⅢ级和宫颈癌）为研究终点，分别以CINⅡ-级（包括正常/炎症和CINⅠ级）和CINⅢ-级（包括正常/炎症﹑CINⅠ级和CINⅡ级）为对照组。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验；非正态分布以中位数和四分位数间距表示；相关性分析采用Spearman相关分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV E6/E7mRNA﹑HR-HPV DNA检测结果与病理诊断比较 由表1可见HPV E6/E7mRNA总阳性率低于HR-HPV DNA的阳性率，差异有统计学意义（P＜0.001）。各组间HPV E6/E7mRNA阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。CINⅡ+级和CINⅢ+级的HPV E6/E7 mRNA阳性率分别高于CINⅡ-级和CINⅢ-级，差异均有统计学意义（P均＜0.001）；HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA两种方法对CINⅡ+级检出率比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 病理诊断及HPV E6/E7mRNA、HR-HPV DNA检测结果［n（%）］

2.2 不同级别宫颈病变的HPV E6/E7mRNA拷贝数结果 HPV E6/E7mRNA拷贝数呈非正态分布，故用中位数和四分位数间距表示。对各组HPV E6/E7mRNA拷贝数进行分析（见表2），差异有统计学意义（P＜0.001）。将宫颈组织病理结果与HPV E6/E7 mRNA水平进行Spearman等级相关分析，两者相关系数r=0.523（P＜0.001），提示HPV E6/E7 mRNA水平与组织学病变程度之间存在正相关性。

表2 不同级别宫颈病变的HPV E6/E7mRNA拷贝数比较

2.3 HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA检测对CINⅡ+级和CINⅢ+级的诊断价值 两种方法检测CINⅡ+级和CINⅢ+级的灵敏度﹑阳性预测值（PPV）﹑阴性预测值（NPV）差异均无统计学意义（P＞0.05）；但两者特异度比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。

3 讨论

ASC-US有潜在高级别CIN的风险，甚至是宫颈癌可能，故应十分重视对ASC-US患者的管理。近年将HR-HPV DNA检测用于ASC-US患者的分流已被普遍用于临床。但有研究指出＞80%的妇女一生中会感染HPV，而＞90%的感染会在8～24个月内会被自身的免疫系统清除，仅＜10%的HR-HPV会持续感染进一步发展为高级别CIN甚至宫颈癌［3］。因为HPV一旦感染，即可检测到，故HR-HPV DNA检测假阳性率高，将其作为ASC-US的分流指标在临床上存在较多争议，在欧洲仍未被推荐为首选的宫颈癌筛查方法［4］。研究已证实，HPVE6/E7蛋白持续性高表达是HPV感染导致宫颈发生癌变的必要条件。在HPV病毒整合至宿主细胞后，HPV病毒过度表达E6/E7，同时E6/E7蛋白通过抑制Rb﹑P53等抑癌基因功能﹑干扰细胞周期调控﹑免疫逃逸等机制最终导致细胞发生癌变［5］。HPVE6/ E7mRNA更能准确地反映HPV病毒在宿主细胞内复制转录的活动状态，对于预测宫颈病变恶性转化和宫颈癌早期筛查具有重要临床意义。有研究建议采用HPV E6/E7mRNA检测作为ASC-US的分流指标［6］。

有文献报道HPVE6/E7mRNA水平与宫颈病变的严重程度相关。Ratnam等［7］研究发现随着宫颈病变的加重，HPVE6/E7mRNA阳性率也随之增加。张凤芹等［8］研究发现CIN患者的HPV E6/E7mRNA拷贝值显著高于无宫颈病变者的HPV E6/E7mRNA拷贝值。本研究发现，CINⅡ+级和CINⅢ+级的HPV E6/E7 mRNA阳性率高于CINⅡ-级和CINⅢ-级组，且不同等级宫颈病变的HPV E6/E7mRNA拷贝数不同，且宫颈病变级别与mRNA拷贝数之间呈正相关。表明在ASC-US患者中，HPV E6/E7mRNA表达水平增加，预示着宫颈病变进展可能性大。而HPV E6/E7 mRNA和HR-HPVDNA检测相比，对CINⅡ+级的检出率差异无统计学意义（P＞0.05），在两种检测结果均阳性的情况下，HPV E6/E7mRNA拷贝水平在宫颈病变严重程度的评估和处理方法的指导上具有更重要的意义。

本研究还发现两种HPV检测方法具有相似的灵敏度﹑PPV和NPV，但HPV E6/E7mRNA检测的特异度明显提高。Dockter J等［9］以CINⅢ+级作为研究终点，分析与HR-HPV DNA检测相比，HPV E6/E7mRNA检测的灵敏度﹑PPV和NPV均相似，但特异度明显升高。作为新一代的生物标记物，HPV E6/E7mRNA检测得到的临床灵敏度和预测值与HR-HPV DNA检测相似，而在临床特异度方面，比HR-HPV DNA检测有了显著提高。相比HR-HPV DNA检测，HPV E6/E7mRNA检测对高级别CIN的诊断价值更高。因此，若将HPVE6/E7mRNA检测用于ASC-US的分流，可比HR-HPV DNA检测减少阴道镜转诊率的同时并不降低灵敏度即高级别宫颈病变的检出率，可以更精确地选择高危人群，减少由过度治疗造成患者一系列的并发症，并能减少医疗资源的浪费。

［1］ Tommasino M．The human papillomavirus family and its role in carcinogenesis．Semin Cancer Biol,2014,26(1):13-21．

［2］ Eversole GM,Moriarty AT,Schwartz MR,et al．Practices of participants in the college of American pathologists interlaboratory comparison program in cervicovaginal cytology,2006．Arch Pathol Lab Med,2010,134(3):331-335．

［3］ Kjaer SK, Breugelmans G, Munk C, et al． Population based prevalence, type and age-specific distribution of HPV in women before introduction of an HPV-vaccination program in Denmark．Int J Cancer, 2008,123(8):1864-1870．

［4］ Lie AK,Kristensen G．Human papillomavirus e6/e7 mRNA testing as a predictive marker for cervical cancinoma．Expert Rev Mol Diagn,2008,8(4):405-415．

［5］ McCloskey R,Menges C,Friedman A,et al．Human papillomavirus type 16 E6/E7 upregulation of nucleophosmin is important for proliferation and inhibition of differentiation．J Virol,2010, 84(10): 5131-5139．

［6］ Sorbye SW,Fismen S,Gutteburg J,et al．HPV mRNA is more specific than HPV DNA in triage of women with minor cervical lesions．PLoS One,2014,9(11):e112934．

［7］ Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al．Clinical performance of the pretect hpv-proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer．J Clin Microbi01,2010,48(8):2779-2785．

［8］ 张凤芹,张清泉,侯素平,等．应用支链DNA技术检测宫颈高危人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA．国际检验医学杂志,2013,34(6):705-706．

［9］ Dockter J,Schroder A,Hill C,et al．Clinical performance of the APTIMA HPV Assay for the detection of high-risk HPV and high-grade cervical lesions．J Clin Virol,2009,45(1):55-61．

Objective To investigate the clinical value of human papillomavirus E6/E7mRNA test in patients with atypical squamous cell of undetermined signifi cance（ASC-US）. Methods Three hundred and twenty patients with ASC-US had HPVE6/E7 mRNA and high-risk（HR）HPV DNA testing.The testing results combined with pathological diagnosis were analyzed. Results The positive rate of HPV E6/E7 mRNA for cervical intraepithelial neoplasia（CIN）II+ and CINIII+ were higher than that of CINII- and CINIII-，and the difference was statistically signifi cant（P＜0.001）.HPV E6/E7mRNA copy number of different grades of cervical lesions was signifi cantly different（P＜0.001）.It was confi rmed that there was positive correlation between the level of cervical lesion and the copies of mRNA.There were no signifi cantly difference（P＞0.05）in sensitivity，positive predictive value，negative predictive value between HPV E6/E7 mRNA test and HR-HPV DNA test for CINII+ and CINIII+，but the specifi city showed statistically signifi cantly difference（P＜0.001）. Conclusion HPVE6/E7mRNA test is more effective in triage of patients with ASC-US，and is currently a better triage test for patients with ASC-US whether or not colposcopy referral.

E6/E7mRNA Human papilloma virus Atypical squamous cell of Undetermined signifi cance

325000 浙江省温州市人民医院（张月辉 潘嫱微郑园园 童郁）

325000 温州医科大学附属第二医院（吕杰强）

*通信作者