三氧化二砷通过Akt信号通路抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡

张顺同，孟 宇，宁怡蒙，宋 敏

郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南郑州450052

三氧化二砷通过Akt信号通路抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡

张顺同，孟 宇，宁怡蒙，宋 敏

郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南郑州450052

目的 探讨三氧化二砷对HGC-27细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法 用1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的三氧化二砷作用于胃癌细胞HGC-27、MKM28、SGC7901，同时以只加入二甲基亚砜(DMSO)溶液的细胞作为对照组，噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况，筛选出受到抑制作用最大的细胞继续研究，并计算三氧化二砷半数抑制浓度。用三氧化二砷半数抑制浓度作用于人胃癌细胞，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blotting检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达水平。用50 ng/ml的Akt信号通路激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及半数抑制浓度的三氧化二砷联合作用于人胃癌细胞作为联合组，以半数抑制浓度的三氧化二砷作用组作为对照，MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blotting检测Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平。结果 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 的三氧化二砷能够抑制胃癌细胞 HGC-27、MKM28、SGC7901 的生长，抑制作用从强到弱依次为:HGC-27、MKM28、SGC7901，半数抑制浓度依次为:(9.34±1.57)μmol/L、(12.92±1.08)μmol/L、(13.24±1.34)μmol/L，后续实验选用9 μmol/L的三氧化二砷作用于HGC-27细胞。9 μmol/L的三氧化二砷作用后细胞凋亡率从(6.35±2.14)% 提高到(39.32±6.54)%，细胞中Cleaved Caspase-3升高，p-Akt水平降低。联合组细胞较单用三氧化二砷组细胞增殖能力增强，细胞凋亡数量减少，细胞中Cleaved Caspase-3水平降低，p-Akt水平升高。结论 三氧化二砷能够抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞凋亡，激活Akt信号通路能够部分逆转三氧化二砷对胃癌细胞增殖、凋亡的影响。

三氧化二砷;胃癌;凋亡;Akt信号通路

胃癌的发病率在全部恶性肿瘤中位居第2位。据统计，在中国，胃癌的死亡率在全部恶性肿瘤中位居第2位，发病率在全部恶性肿瘤中位居第3位［1］。胃癌发病隐匿、早期症状不明显，发现时一般已经是胃癌晚期。据统计，胃癌5年内的生存率只有30%［2］。目前常用的治疗胃癌的方法为手术治疗，但是手术治疗已经远远不能满足人们的需求，寻找有效的治疗方法是目前急需解决的问题。

三氧化二砷是一种提取至砒霜中的有效成分，其最初被用于治疗急性早幼粒细胞型白血病，随着不断的深入研究发现，三氧化二砷对肿瘤细胞的生长也具有一定的抑制作用，并且能够通过抑制实体瘤细胞增殖进而抑制其体外裸鼠成瘤的能力［3-5］。蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路在肿瘤细胞的生长过程中发挥调控作用，而三氧化二砷是否通过作用于Akt信号通路影响胃癌细胞的生长和凋亡，本研究中首先探讨三氧化二砷对胃癌细胞增殖凋亡的作用，进一步运用Akt信号通路激活剂胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)作用于胃癌细胞，研究三氧化二砷对胃癌细胞的作用机制是否与Akt信号通路有关，以期为胃癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 胃癌细胞 HGC-27、MKM28、SGC7901均购自中科院上海细胞库。

1.2 主要仪器及试剂 青霉素、链霉素、RPMI 1640培养基均购自美国Hyclone;新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)购自美国Sigma;Cleaved Caspase-3单克隆抗体、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)单克隆抗体、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体均购自美国 CTS;NorapathTM酶联免疫检测仪购自日本BID-KAD;CKX41倒置显微镜购自日本Olympus;FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国BD。

1.3 细胞培养 人胃癌细胞 HGC-27、MKM28、SGC7901细胞培养参照参考文献［6］，细胞培养液均采用含有青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml、100 g/L新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，培养条件为37℃，饱和湿度，体积分数为5%的CO2培养箱，观察细胞密度达到90%时，用含2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞1 min，1 000 r/min离心10 min后，以1∶3的比例接种到细胞培养瓶中，每隔2～3 d进行1次传代。

1.4 MTT检测细胞增殖 观察人胃癌细胞HGC-27、MKM28、SGC7901培养至对数生长期时，用含有2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞后，以每孔中加入5×104个细胞接种至96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl的细胞悬浮液，培养过夜。弃上清液，加入含有三氧化二砷浓度为 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的细胞培养液继续培养48 h，每个浓度设置5个复孔，同时设置对照组，对照组中只加入等量的DMSO溶液，以不加细胞组为空白组。培养结束后，每孔加入20 μl的含有噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT)浓度为5 g/L的溶液，放在37℃反应4 h，吸除上清液，加入DMSO溶液150 μl，震荡反应10 min，观察结晶物完全融化后，用酶联免疫检测仪在490 nm处检测每孔的吸光度值，分析细胞增殖情况。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将胃癌细胞HGC-27以1×105ml-1接种到6孔细胞培养板中，每孔加入2 ml的细胞悬浮液，培养过夜后，更换为含有三氧化二砷半数抑制浓度的细胞培养液，37℃室温培养48 h后，加入胰蛋白酶消化细胞，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)悬浮细胞后，调整细胞浓度为1×106ml-1，收集1 ml的细胞悬浮液，加入400 μl的缓冲液混合后，依次加入5 μl碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)和膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)混合后，在避光、室温条件下反应20 min，加入200 μl的缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blotting检测细胞中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平 胃癌细胞HGC-27经三氧化二砷半数抑制浓度的细胞培养液作用48 h后，用细胞刮刀收集细胞，加入裂解液，按照细胞蛋白提取试剂盒说明书提取细胞中的总蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒对蛋白样品进行定量检测。将蛋白样品与5×上样缓冲液充分混合，混合比例为4∶1，在100℃的水浴锅中煮沸5 min，使蛋白样品变性。在凝胶上样孔中每孔加入50 μl的变性蛋白样品，电泳初始电压为80 V，待溴酚蓝进入分离胶后，把电压调整到120 V直至电泳结束。蛋白凝胶在100 V电压，4℃转膜90 min，用50 g/L脱脂奶粉在37℃封闭90 min后，依次与一抗(600倍稀释，4℃孵育过夜)和二抗(1 200倍稀释，37℃孵育90 min)结合后，滴加显色液，放置于暗室中显影，分析目的蛋白相对表达水平。

1.7 Akt信号通路激活剂对细胞增殖影响 检测含有三氧化二砷半数抑制浓度和50 ng/ml的IGF的细胞培养液作用于胃癌细胞HGC-27作为联合组，同时以半数抑制浓度的三氧化二砷作用于胃癌细胞HGC-27作为对照，培养48 h后，MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blotting检测细胞中 Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平，步骤参照1.4、1.5、1.6。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0统计学软件分析，计量资料以±s表示，两组数据比较用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖检测结果 如表1所示，人胃癌细胞HGC-27、MKM28、SGC7901 经 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 的三氧化二砷作用后细胞增殖能力下降，计算三氧化二砷对胃癌细胞HGC-27、MKM28、SGC7901的半数抑制浓度依次为:(9.34 ±1.57)μmol/L、(12.92 ±1.08)μmol/L、(13.24±1.34)μmol/L。三氧化二砷对胃癌细胞抑生长作用由强到弱依次为:HGC-27、MKM28、SGC7901。后续研究中选用受到抑制作用最强的HGC-27细胞继续研究，三氧化二砷浓度选用半数抑制浓度9 μmol/L继续研究。

表1 三氧化二砷作用48 h后的胃癌细胞吸光度值Tab 1 Absorbance of gastric cancer cells after arsenic trioxide for 48 hours

2.2 细胞凋亡检测结果 检测三氧化二砷对胃癌细胞HGC-27凋亡的影响，结果如图1所示，对照组和三氧化二砷组细胞凋亡率分别为(6.35±2.14)%、(39.32±6.54)%。提示三氧化二砷能够促进胃癌细胞凋亡。

2.3 细胞中 Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平检测结果 如图2所示，三氧化二砷作用后的胃癌细胞HGC-27中Cleaved Caspase-3水平升高，p-Akt水平降低，Akt水平无显著性变化。以GAPDH为内参，统计对照组和三氧化二砷组中Cleaved Caspase-3水平依次为0.15±0.02、0.86±0.21，p-Akt表达水平依次为:0.23±0.03、0.08±0.04，Akt水平依次为:0.94 ±0.06、0.95 ±0.05。提示三氧化二砷能够促进胃癌细胞Cleaved Caspase-3的表达，抑制胃癌细胞中p-Akt表达水平。

图1 三氧化二砷对细胞凋亡影响结果Fig 1 Effects of arsenic trioxide on apoptosis

图2 三氧化二砷对细胞中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达影响结果Fig 2 Effect of arsenic trioxide on expressions of Cleaved Caspase-3，Akt and p-Akt in cells

2.4 激活Akt信号通路对细胞增殖的影响 用三氧化二砷和Akt信号通路激活剂共同作用于胃癌细胞HGC-27，检测细胞中Akt磷酸化水平，如图3、表2所示，以单用三氧化二砷作用组作为对照，三氧化二砷和Akt信号通路激活剂联合作用后的细胞中Akt磷酸化水平升高。检测细胞增殖情况，如表2所示，以单独用三氧化二砷作用组作为对照，三氧化二砷和Akt信号通路激活剂联合作用后的细胞A值升高，说明Akt信号通路激活剂能够部分拮抗三氧化二砷对胃癌细胞增殖的抑制作用。

2.5 激活Akt信号通路对细胞凋亡的影响 进一步检测三氧化二砷及Akt信号通路激活剂联合作用后的细胞凋亡情况，结果如图4、表3所示，加入Akt信号通路激活剂后的胃癌细胞凋亡率从(45.21±3.64)%降低至(34.62±4.39)%。如图5、表3所示，加入Akt信号通路激活剂后的胃癌细胞中Cleaved Caspase-3表达水平从1.05±0.09降低至0.21±0.06。Akt信号通路激活剂能够逆转三氧化二砷诱导的胃癌细胞凋亡。

图3 Akt信号通路激活剂对三氧化二砷诱导的Akt磷酸化水平降低的影响Fig 3 Effect of Akt signaling pathway activator on the level of Akt phosphorylation induced by arsenic trioxide

表2 Akt信号通路激活剂及三氧化二砷联合作用48 h后细胞吸光度值及细胞中p-Akt、Akt表达水平(±s)Tab 2 Absorbance and p-Akt，Akt levels in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

表2 Akt信号通路激活剂及三氧化二砷联合作用48 h后细胞吸光度值及细胞中p-Akt、Akt表达水平(±s)Tab 2 Absorbance and p-Akt，Akt levels in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

注:与三氧化二砷组比较，*P＜0.01。

组别 吸光度值 蛋白相对表达水平p-Akt Akt三氧化二砷组0.83±0.03 0.34±0.05 1.05±0.08联合组 1.12±0.02* 0.78±0.06*1.07±0.03

图4 激活Akt信号通路对细胞凋亡影响Fig 4 Activation of Akt signaling pathway on apoptosis

图5 激活Akt信号通路对细胞中Cleaved Caspase-3表达影响Fig 5 Effect of activation of Akt signaling pathway on Cleaved Caspase-3 expression in cells

表3 Akt信号通路激活剂及三氧化二砷联合作用48 h后细胞凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3表达水平(±s)Tab 3 The apoptosis rate and the expression level of Cleaved Caspase-3 in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

表3 Akt信号通路激活剂及三氧化二砷联合作用48 h后细胞凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3表达水平(±s)Tab 3 The apoptosis rate and the expression level of Cleaved Caspase-3 in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

注:与三氧化二砷组比较，*P＜0.01。

组别 细胞凋亡率(%)蛋白相对表达水平三氧化二砷组45.21±3.64 1.02±0.09联合组 34.62±4.39* 0.21±0.06*

3 讨论

三氧化二砷是一种剧毒物质，微量的三氧化二砷能够导致慢性中毒，严重的可以引发癌症。最近的研究表明，极少量的三氧化二砷能够促进细胞增殖，并且三氧化二砷在体内的代谢较快，在血浆内几乎没有残留［7］。三氧化二砷能够抑制肿瘤细胞的DNA和RNA合成，阻碍细胞内核酸物质的代谢途径，进而导致肿瘤细胞生长受到抑制［8-10］。三氧化二砷能够阻滞胃癌细胞SGC-7901的细胞周期，增加静止期的细胞数量，进而导致增殖期细胞数量减少，抑制胃癌细胞的生长［11-14］。本研究中，选用了三种胃癌细胞株HGC-27、MKM28、SGC7901，用不同浓度为三氧化二砷作用于胃癌细胞，MTT检测发现，三氧化二砷能够降低胃癌细胞株HGC-27、MKM28、SGC7901的增殖能力，这与之前的研究结果一致。本研究还发现，三氧化二砷对胃癌细胞HGC-27的抑生长作用最为明显，计算其半数抑制浓度为(9.34±1.57)μmol/L，后续研究中选用9 μmol/L的三氧化二砷作用于HGC-27细胞。

癌细胞凋亡是癌症发生过程中的重要生物学现象，促进癌细胞凋亡是癌症治疗的有效途径之一［15］。癌细胞凋亡与Caspase级联反应有关，Caspase-3是Caspase级联反应中的效应因子，是细胞凋亡的执行因子，Caspase-3活化后意味着细胞凋亡进入不可逆的阶段［16］。之前的研究表明，三氧化二砷能够通过作用于NF-κB促进胃癌细胞的凋亡［17］。本研究中，通过流式细胞术检测了三氧化二砷对胃癌细胞HGC-27凋亡的影响，结果发现，三氧化二砷能够促进胃癌细胞凋亡，凋亡率从(6.35±2.14)%提高至(39.32±6.54)%，与之前的研究结果一致。本研究中还进一步发现，三氧化二砷作用后的HGC-27细胞中Caspase-3活化增多。以上结果均提示，三氧化二砷能够作用于Caspase-3的活化水平促进胃癌细胞HGC-27的凋亡。

Akt信号通路是目前研究较多的与癌细胞生长有关的信号传导通路［18］。已经有研究［19］表明，Akt在肺癌、食管癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌症中异常活化，癌组织中Akt磷酸化水平升高。50 ng/ml的IGF能够激活Akt信号通路，进而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞生长［20］。本研究中，首先发现三氧化二砷作用后的胃癌细胞HGC-27中Akt磷酸化水平降低，用Akt信号通路激活剂IGF和三氧化二砷联合作用于人胃癌细胞HGC-27后，与单用三氧化二砷作用后的胃癌细胞相比，增殖能力增强，凋亡数量减少。提示，激活Akt信号通路能够部分逆转三氧化二砷诱导的胃癌细胞凋亡增多和增殖能力减弱。

综上所述，三氧化二砷能够促进胃癌细胞HGC-27凋亡，抑制胃癌细胞HGC-27增殖，而激活Akt信号通路能够部分逆转三氧化二砷对胃癌细胞增殖凋亡的影响。这为进一步研究三氧化二砷对胃癌细胞的作用机制奠定了基础，为治疗胃癌提供了新的理论依据。

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(责任编辑:李 健)

Arsenic trioxide inhibits HGC-27 cell proliferation and promotes apoptosis through Akt signaling pathway

ZHANG Shuntong，MENG Yu，NING Yimeng，SONG Min
Department of Oncology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

ObjectiveTo investigate the effect and its mechanism of arsenic trioxide on proliferation and apoptosis of HGC-27 cells.Methods1 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L，16 μmol/L of arsenic trioxide were injected into gastric cancer cells HGC-27，MKM28，SGC7901，at the same time，only the DMSO solution was added to the control group.Cell proliferation was detected by MTT.The cells with the greatest influence were screened and the half inhibitory concentration was calculated.Half inhibitory concentration of arsenic trioxide was calculated.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Western blotting was used to detect the levels of Cleaved Caspase-3，Akt and p-Akt in cells.The combination of 50 ng/ml Akt signal pathway activator IGF and half inhibitory concentration of arsenic trioxide on human gastric cancer cells were recorded as a combined group.Arsenic trioxide group with half inhibitory concentration was as control.Cell proliferation was detected by MTT.Apoptosis was detected by flow cytometry.Western blotting was used to detect the levels of Cleaved Caspase-3，Akt，p-Akt.Results1 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L，16 μmol/L of arsenic trioxide could inhibit the growth of gastric cancer cells HGC-27，MKM28，SGC7901.The inhibitory effects from strong to weak were HGC-27，MKM28，SGC7901.The half inhibition concentrations were(9.34±1.57)μmol/L，(12.92±1.08) μmol/L，(13.24±1.34) μmol/L.The following experiments were conducted with 9 μmol/L arsenic trioxide on HGC-27 cells.The rate of apoptosis was increased from(6.35 ±2.14)%to(39.32 ±6.54)%by the action of arsenic trioxide at a dose of 9 μmol/L，Cleaved Caspase-3 was increased in cells，p-Akt level was decreased.The proliferation ability of the combined group was higher than that of arsenic trioxide group，cell apoptosis was decreased，the level of Cleaved Caspase-3 was decreased in cells，p-Akt level was increased.ConclusionArsenic trioxide can inhibit the proliferation of gastric cancer cells and promote the apoptosis of gastric cancer cells.The activation of Akt signaling pathway can partly reverse the effects of arsenic trioxide on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells.

Arsenic trioxide;Gastric cancer;Apoptosis;Akt signaling pathway

R735.2

A

1006-5709(2017)08-0910-05

2017-02-22

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.019

张顺同，硕士研究生，研究方向:消化道肿瘤基础与临床。E-mail:doctor_z163@163.com

宋敏，教授，主任医师，研究方向:消化道肿瘤的基础与临床。E-mail:minsong2011@163.com