二甲双胍对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡的影响

程贝贝，冯 如，陈光侠，费素娟

1.徐州医科大学，江苏徐州221002;2.徐州市第一人民医院消化内科;3.徐州医科大学附属医院消化内科

二甲双胍对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡的影响

程贝贝1，冯 如1，陈光侠2，费素娟3

1.徐州医科大学，江苏徐州221002;2.徐州市第一人民医院消化内科;3.徐州医科大学附属医院消化内科

目的 研究二甲双胍对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，并初步探讨其可能的机制。方法 用不同浓度的二甲双胍处理人结肠癌HCT116细胞48 h后，采用细胞增殖检测试剂(CCK-8)实验检测其对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测其对细胞凋亡及周期的影响;Western blotting法检测二甲双胍对HCT116细胞中bcl-2、Casepase-3及p53蛋白的影响。结果分别采用2.5、5、10、20和40 mmol/L二甲双胍处理HCT116细胞48 h后，CCK-8实验表明，各浓度组均可引起结肠癌细胞的增殖抑制作用，呈浓度依赖性;流式细胞仪术结果显示，经药物处理后，与对照组相比，细胞凋亡细胞比例逐渐增加。另外，肿瘤细胞G0/G1期细胞比例无明显改变，S期细胞的比例减少，但G2/M期细胞的比例逐渐升高;Western blotting检测显示，二甲双胍可抑制抗凋亡蛋白bcl-2的表达，激活Casepase-3、p53蛋白表达。结论 二甲双胍可抑制结肠癌细胞增殖，G2/M期细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，其作用机制可能与抑制bcl-2的表达，活化Casepase-3、p53蛋白表达有关。

二甲双胍;HCCT116;增殖;凋亡;周期

二甲双胍是一种口服双胍类降糖药物，是治疗2型糖尿病一线用药，尤其适用于超重和肥胖的患者，临床使用已证明了该药的临床安全性［1］。近年来，流行病学研究和病例对照研究证实2型糖尿病是肿瘤的危险致病因素之一［2］。自Evans等［3］首次发现二甲双胍可以降低2型糖尿病患者的多种肿瘤的发病率，随着肿瘤治疗研究的不断深入，二甲双胍作为一种常用的降糖药，其抗肿瘤作用越来越受到关注。目前有研究［4-7］表明，二甲双胍可降低乳腺癌、肝癌、皮肤癌、子宫内膜癌等多种肿瘤的发病率及死亡率，但具体产生这一影响的机制尚不明确。本研究以人结肠癌细胞株HCT116为模型，采用不同剂量的二甲双胍处理细胞，检测其对细胞增殖能力、凋亡及细胞周期的影响，并初步探索其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 结肠癌HCT116细胞购自中国科学院细胞库，RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰酶均购自HyClone公司，二甲双胍购自Smiga公司，CCK8、细胞周期及凋亡试剂盒购自南京凯基公司，bcl-2、Casepase-3及p53购自Abcam公司。

1.2 细胞培养 HCT116细胞用含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，将细胞置于37℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中，隔天传代换液，当细胞融合至80%时用2.5 g/L胰酶消化传代培养至对数生长期。

1.3 CCK-8检测细胞增殖 将处于对数生长期的结肠癌HCT116细胞用胰酶消化后，以5×103个/孔细胞接种于96孔培养板中，待细胞融合至70%后分别加入二甲基亚砜(DMSO)和不同浓度的二甲双胍(终浓度分别为 2.5、5、10、20、40 mmol/L)，37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养24 h后，每孔加入100 μl培养基及10 μl CCK-8检测试剂，继续孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm处OD值。设3个复孔。

1.4 AnnexinV-Fitc/PI双染检测细胞凋亡 收集处于对数生长期的不同处理组细胞，将细胞调整至5×105ml-1并加入结合缓冲液 Bing buffer 500 μl，先加入5 μl AnnexinV-Fitc，再加入 5 μl碘化丙啶(PI)，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 细胞周期 二甲双胍处理48 h后，各组细胞胰酶常规消化，PBS洗涤2次，然后加入1 ml 750 g/L的冰乙醇，4℃固定过夜，PBS洗涤3次，弃去上清，加入RNA酶及PI调整终浓度为50 μg/ml，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期，比较各期细胞比例。

1.6 Western blotting检测 收集不同浓度的二甲双胍处理后48 h的各组细胞，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备浓度为12%的胶，每孔上样20 μg，恒定电流100 mA电泳1 h后，转至PVDF膜，37℃脱脂奶粉封闭1 h，加入β-actin、bcl-2、Caspase-3及p53一抗，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，用相应二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h，PBST洗涤3次，ECL化学发光显影。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，组内比较采用t检验，不同处理组间用单因素方差分析进行比较，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍对HCT116细胞增殖的影响 CCK-8结果显示，经过 2.5、5、10、20、40 mmol/L 二甲双胍处理48 h后，结肠癌HCT116细胞增殖受到明显的抑制，且呈浓度依赖性，各组抑制率分别为20.8%、27.9%、36.9%、50.9%、68.9%，各浓度组与对照组比较、各浓度组组间比较，差异均有显著统计学意义(P＜0.01，见图1)。提示二甲双胍能抑制结肠癌HCT116细胞增殖。

图1 二甲双胍对HCT116细胞增殖的影响Fig 1 Effect of metformin on the proliferation of HCT116 cells

2.2 二甲双胍对HCT116细胞凋亡的影响 经二甲双胍作用于HCT116细胞后，细胞凋亡率明显升高，对照组凋亡率为 (8.15 ±0.91)%;而 2.5、5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理后细胞凋亡率分别为(15.28±0.61)%、(19.15±0.53)%、(25.3±0.51)%、(31.6±0.87)%、(39.23±0.49)%，各浓度组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);二甲双胍处理组凋亡细胞比例随药物浓度增加而升高，结果提示，二甲双胍对HCT116细胞凋亡具有促进作用(见图2)。

2.3 二甲双胍对HCT116细胞周期的影响 流式细胞仪观察二甲双胍作用于HCT116细胞48 h对其细胞周期分布的影响表明:相较于对照组，G0/G1期细胞无明显改变，S期细胞的比例减少，G2/M期细胞的比例增加(P＜0.05)，细胞周期阻滞，且呈明显的剂量依赖性(见图3)。

2.4 二甲双胍对HCT116细胞中bcl-2、Casepase-3、p53表达的影响 Western blotting结果显示:二甲双胍作用于HCT116细胞48 h后，与对照组相比，抗凋亡蛋白bcl-2相对表达量明显降低，同时可以激活凋亡相关蛋白Casepase-3、肿瘤抑制基因p53的表达，且呈剂量依赖性(见图4)。

3 讨论

结肠癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均较高，严重威胁着人类的生命和健康，死亡率仅次于肺癌和肝癌，严重危害人类的健康［8］。尽管目前对结肠癌的诊治水平有了较大提高，主要包括早期筛查、手术切除患病部位及化疗等方式，但许多患者就医时已错过了手术治疗时机，治疗效果仍不乐观。二甲双胍作为一种口服降糖药，具有减轻胰岛素抵抗、降低血脂等特点。近年来，二甲双胍还被发现具有预防和治疗肿瘤的作用。张艳飞等［9］研究显示，2型糖尿病合并结直肠癌患者口服二甲双胍降糖，其肿瘤的预后恢复良好。二甲双胍在结肠癌治疗中的作用机制尚不明确，尽管已经有研究［10-11］表明，二甲双胍能够抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖，促进细胞凋亡，但SW480为中分化结肠癌细胞株，本研究采用的HCT116为低分化结肠癌细胞株，两个研究相互补充，共同研究二甲双胍对结肠癌发生、发展产生的影响。

图2 二甲双胍对HCT116细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of metformin on the apoptosis of HCT116 cells

图3 二甲双胍对HCT116细胞周期的影响Fig 3 Effect of metformin on the cell cycle of HCT116 cells

图4 二甲双胍对bcl-2、Casepase-3、p53的影响Fig 4 Effects of metformin on bcl-2，Casepase-3 and p53

本研究分别观察了二甲双胍对HCT116细胞增殖、凋亡及周期的影响。目前有许多研究证实，二甲双胍对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用，本研究中CCK-8法检测二甲双胍对结肠癌HCT116细胞增殖影响，结果显示，二甲双胍在体外能够抑制HCT116细胞增殖，且随浓度的增加，该抑制作用更加明显;细胞S期细胞比例不断减少，G2/M期细胞比例不断升高，产生细胞阻滞。

肿瘤的发生、发展与细胞过度增殖和凋亡减少有关。bcl-2家族基因是调控细胞内凋亡的重要基因，bcl-2是bcl-2家族中重要分子，主要起抑制细胞凋亡的作用。Caspase家族是凋亡发生的执行子，凋亡发生最终引起Caspase活化后一系列级联反应。Caspase-3不仅是细胞凋亡的下游分子，也是效应分子，Caspase-3被激活后，细胞凋亡基本上是不可避免的［12］。p53基因在防止细胞过度增殖及保持DNA受损基因组的完整性上都有重要作用，其表达增加可直接引起细胞凋亡［13］。研究结果已显示:二甲双胍能够抑制结肠癌细胞增殖、诱导凋亡，为进一步分析产生这一作用的具体机制，我们观察了二甲双胍对HCT116细胞中凋亡相关蛋白表达的影响，结果发现，二甲双胍处理48 h后，bcl-2表达量降低，细胞中Caspase-3、p53相对表达量高于对照组，提示二甲双胍可能是通过调节凋亡相关蛋白bcl-2、Caspase-3、p53从而发挥促进细胞凋亡的作用，且这种作用可能呈浓度依赖性。

结合上述研究结果显示，二甲双胍在体外能有效抑制HCT116细胞增殖，并诱导细胞凋亡，产生G2/M期细胞阻滞，其机制可能是通过抑制抗凋亡蛋白bcl-2的表达，同时激活p53/Caspase-3信号通路、促进结肠癌细胞凋亡实现的，为二甲双胍作为结肠癌治疗药物提供了新的依据。

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《胃肠病学和肝病学杂志》编辑部

The effects of metformin on proliferation and apoptosis in colon cancer HCT116 cells

CHENG Beibei1，FENG Ru1，CHEN Guangxia2，FEI Sujuan3
1.Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002;2.Department of Gastroenterology，the First People’s Hospital of Xuzhou;3.Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，China

ObjectiveTo observe the effects of metformin on proliferation and apoptosis in colon cancer HCT116 cells and investigate its possible mechanism.MethodsTreated with different concentrations of metformin in colon cancer HCT116 cells after 48 hours，the proliferation of HCT116 cells was assessed by CCK-8 assay，the cell apoptosis and cycle changes were analyzed by flow cytometry.The expressions of bcl-2，Casepase-3 and p53 in the treated HCT116 cells were detected by Western blotting.ResultsTreated with 2.5，5，10，20 and 40 mmol/L of metformin in HCT116 cells after 48 hours，CCK-8 assay showed that the different concentrations of metformin decreased the proliferation of HCT116 cells in a dose-dependent manner.Flow cytometry results demonstrated that，compared with the control group，after treated with metformin，the apoptosis of cells increased gradually.In addition，tumor cells at G0/G1phase had no obvious change，S phase cells decreased，but G2/M phase cells increased gradually;Western blotting showed that metformin could inhibited antiapoptotic proteins expression of bcl-2，meanwhile activated Casepase-3，p53 protein expression.ConclusionMetformin can inhibit proliferation of colon cancer cell，block the cell cycle at G2/M phase，induce apoptosis mainly by down-regulating the expression of bcl-2，activating Casepase-3，p53 protein expression.

Metfomlin;HCT116;Proliferation;Apoptosis;Cell cycle

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0857-04

2017-02-09

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.005

费素娟，教授，硕士生导师，研究方向:消化道肿瘤的临床与基础。E-mail:xyfyfeisj99@163.com