抑制iASPP基因对大肠癌细胞凋亡作用的实验研究

王长松，范乃军，吕学霞，贠 田，蒙念龙，原旭涛，李富林，王志成

1.中国人民解放军第150中心医院病理科，河南洛阳471031;2.中国人民解放军第153中心医院病理科

抑制iASPP基因对大肠癌细胞凋亡作用的实验研究

王长松1，范乃军1，吕学霞1，贠 田1，蒙念龙1，原旭涛1，李富林1，王志成2

1.中国人民解放军第150中心医院病理科，河南洛阳471031;2.中国人民解放军第153中心医院病理科

目的 通过构建针对p53凋亡抑制蛋白(inhibitory member of the apoptosistimulating protein of p53，iASPP)的RNAi质粒，研究在体内外抑制iASPP基因表达后对大肠癌细胞HT-29凋亡的影响。方法 构建iASPP的腺病毒RNAi质粒pAd-iASPP-RNAi，体外转染HT-29细胞，同时建立HT-29的裸鼠移植瘤模型;采用RT-PCR和Western blotting检测转染后瘤细胞iASPP基因在mRNA和蛋白质水平的变化;采用流式细胞仪检测转染前后瘤细胞凋亡的变化。结果 转染iASPP RNAi后，与阴性对照组、空载病毒对照组相比，HT-29细胞的iASPP mRNA及蛋白表达量均降低;iASPP-RNAi组HT-29细胞的凋亡率、坏死率与阴性对照组及空白病毒对照组相比显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。裸鼠移植瘤细胞在病毒转染后，细胞体积增大，核染色质浓集，出现凋亡;移植瘤细胞的凋亡率、坏死率与阴性对照组、空载病毒对照组相比显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 在体内外抑制iASPP基因的表达能够促进大肠癌细胞HT-29的凋亡，iASPP有可能成为大肠癌分子免疫治疗的靶标。

iASPP;HT-29细胞;RNAi;凋亡

随着分子医学的发展，恶性肿瘤的分类、诊断、治疗及预后的判断将逐渐以分子标志物为基础。EGFR、ALK等基因在非小细胞肺癌中的成功应用为恶性肿瘤的治疗带来了希望。结直肠癌作为我国发病率第一的消化系统肿瘤，其发病率逐年上升，且呈年轻化趋势，严重威胁国人健康。p53凋亡刺激蛋白(apoptosisstimulating protein of p53，ASPP)家族在p53蛋白的下游分子通路上发挥关键性的生物学作用，该家族成员的发现丰富了p53蛋白在肿瘤中的作用，进一步增强了对p53基因的认识。

ASPP家族共有3个成员，即 ASPP1、ASPP2和p53凋亡抑制蛋白(inhibitory member of the apoptosis-timulating protein of p53，iASPP)，三个分子在体内的生物学作用有所不同，ASPP1/ASPP2与p53结合促使DNA损伤的细胞发生凋亡，有抑制肿瘤的效应;而iASPP属于癌基因，其与p53蛋白结合后能够抑制细胞凋亡的发生［1］。三者具有相同的p53结合区域，因此在与p53结合时具有竞争效应，哪个蛋白先与p53结合，结合位点即被封闭，后来者无法再与p53结合。p53能够诱导DNA损伤细胞发生周期阻滞或直接诱导细胞走向凋亡，在大肠癌中超过1/2的患者存在p53基因的突变或缺失［2］。作为ASPP家族中唯一能抑制细胞凋亡的基因，抑制iASPP的表达是否能够促进肿瘤细胞的凋亡呢?阻断iASPP与p53相结合，强化ASPP1/ASPP2的竞争能力，逆转ASPP1/ASPP2的促凋亡活性，可能是一个新的有效的肿瘤免疫治疗策略和方向。本文通过对大肠癌细胞HT-29中的iASPP阻断从而观察瘤细胞的凋亡情况，为进一步研究iASPP的功能及其在大肠癌中是否能够成为潜在的分子免疫治疗靶标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠癌细胞株 HT-29、pAd-iASPP-RNAi、XL-Gold菌、293细胞由本实验室保存;mRNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒、Ex Taq酶购自大连宝生物公司;AMV反转录酶购自Promega公司;Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒购自Biovision公司;兔抗人多克隆抗体iASPP购自Abcam公司。二抗购自福州迈新生物技术开发有限公司。BALB/C裸鼠购自上海药物研究所等级动物中心。

1.2 引物 p53和iASPP引物序列参照文献［3］合成，具体如下:p53上游:5'-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3'，下游:5'-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3'，产物大小:293 bp。iASPP 上游:5'-GATGAACTGACCAAGCA-3';下 游:5'-CTCCCTCCAAGG CAAC-3'，产物大小:753 bp。

1.3 大肠癌HT-29细胞株中iASPP mRNA的表达及p53状态检测 取1×106个对数生长期的细胞，提取总RNA，按照RT-PCR试剂盒的说明进行cDNA第一链的合成，PCR反应，产物纯化，琼脂糖凝胶电泳，测序，判定HT-29细胞中p53基因的状态。

1.4 pAd-iASPP-RNAi转染后对大肠癌细胞的影响 取对数生长期的HT-29细胞，调整细胞密度，按1∶10、1∶20、1∶30 的不同浓度比例将 pAd-iASPP-RNAi加入24孔板中，每组设3个复孔，共分为:阴性对照组、空载病毒对照组、pAd-iASPP-RNAi组。培养48 h后，收集细胞，抽提RNA，检测iASPP mRNA的表达，Western blotting方法检测iASPP蛋白的表达。

1.5 流式细胞术检测pAd-iASPP-RNAi转染后HT-29细胞的凋亡 取对数生长期的HT-29细胞，分组同上，调整细胞密度至1×106ml-1;取1×106个细胞，1 000 r/min，低温离心10 min，弃上清。用预冷 PBS液洗涤并重悬细胞于缓冲液中，按照Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒说明进行凋亡检测。

1.6 裸鼠移植瘤模型的建立 取对数生长期的HT-29细胞，弃培养基后用37℃预温的PBS洗涤细胞3次;制备单细胞悬液，用含100 g/L胎牛血清1640培养基重悬细胞，每只裸鼠注射HT-29细胞约5×108个，每3 d注射1次，直至有瘤块出现。

1.7 pAd-iASPP-RNAi对裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响 取移植瘤裸鼠模型随机分为3组，分别于瘤块局部注射pAd-iASPP-RNAi病毒上清、空载病毒对照和阴性对照(注射等量的生理盐水)。每3 d注射1次，连续注射2次。注射完毕1周后，处死裸鼠，取移植瘤标本制备成单细胞悬液，PBS洗涤细胞后调整细胞密度至2×106ml-1;Annexin-V-FITC/PI染液重悬细胞，室温下孵育15 min后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡的变化。

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验;计数资料以例数(%)表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HT-29细胞的p53状态 HT-29细胞的RT-PCR产物测序后与NCBI/Blaster上的p53标准序列进行比对，结果显示，HT-29细胞表达突变型p53基因。

2.2 HT-29细胞中iASPP mRNA的表达 HT-29细胞经提取总 RNA 后进行 RT-PCR，10 μl产物和1 μl的10×上样缓冲液混合，14 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察到一条753 bp的产物条带(见图1)。

图1 iASPP mRNA在HT-29细胞中的表达Fig 1 Expression of iASPP mRNA in HT-29 cells

2.3 pAd-iASPP-RNAi的腺病毒包装 限制性内切酶线性化pAd-iASPP-RNAi后转染AD-293细胞，培养1周后镜下观察细胞出现空泡样改变，有绿色荧光蛋白GFAP的表达(见图2)，收集病毒上清再次感染AD-293细胞，细胞沉积物提取RNA进行PCR扩增，电泳观察到1条753 bp大小的条带即为插入的片段(见图3)。将重组腺病毒在AD-293细胞中大量扩增后，收集含病毒的培养上清，反复冻融后分装，供下一步应用。

图2 AD-293细胞的荧光表达Fig 2 Fluorescent expression of AD-293 cells

图3 pAd-iASPP-RNAi感染AD-293细胞后PCR扩增结果Fig 3 Results of PCR amplification after pAd-iASPP-RNAi infection in AD-293 cells

2.4 pAd-iASPP-RNAi处理后HT-29细胞中iASPP mRNA及蛋白的变化 pAd-iASPP-RNAi病毒感染HT-29细胞后，iASPP mRNA及蛋白表达水平均有不同程度的下降，相对值分别为93.2%和91.5%，与空载病毒对照组、阴性对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.01，见图4)。

图4 pAd-iASPP-RNAi转染HT-29细胞后iASPP mRNA(A)及蛋白(B)的变化 1:空载病毒对照组;2:阴性对照组;3:pAd-iASPP-RNAi组Fig 4 Changes of iASPP mRNA(A)and protein(B)after pAd-iASPP-RNAi transfection in HT-29 cells 1:empty virus control group;2:negative control group;3:pAd-iASPP-RNAi group

2.5 流式细胞术检测pAd-iASPP-RNAi处理后HT-29细胞凋亡的变化 经pAd-iASPP-RNAi处理后，HT-29细胞的凋亡率、坏死率与空载病毒对照组、阴性对照组相比，差异有显著统计学意义(P＜0.01，见表1)。

表1 pA-iASPP-RNAi处理HT-29后细胞凋亡率和坏死率的变化(±s，%)Tab 1 The changes of apoptosis and necrosis percentage after HT-29 treatment with pAd-iASPP-RNAi(±s，%)

表1 pA-iASPP-RNAi处理HT-29后细胞凋亡率和坏死率的变化(±s，%)Tab 1 The changes of apoptosis and necrosis percentage after HT-29 treatment with pAd-iASPP-RNAi(±s，%)

注:与空载病毒对照组、阴性对照组相比，aP＜0.01。

组别 凋亡率 坏死率阴性对照组10.2±1.6 9.8±0.8空载病毒对照组 11.4±2.1 12.1±1.7 pAd-iASPP-RNAi组 67.8±5.3a 22.7±3.2a

2.6 HT-29大肠癌细胞株裸鼠移植瘤模型的建立裸鼠皮下注射HT-29细胞悬液3次后，注射局部逐渐出现小的皮下结节，质地较软，相对活动，随后进行性增大，质地变硬，与周围组织粘连，不易推动，表面皮肤小血管扩张。镜下见移植瘤细胞与体外培养细胞具有相似的形态学特点，细胞排列紊乱，胞浆丰富，胞核深染，上皮样，异型性显著。3周后将移植瘤裸鼠随机分为3组，分别局部注射pAd-iASPP-RNAi、空载病毒、生理盐水对照。大体观察裸鼠的变化不明显;组织学观察，可见pAd-iASPP-RNAi处理后瘤细胞体积增大，胞浆丰富、变淡，细胞核染色质浓集，部分细胞可见嗜酸性坏死、碎片状坏死，甚至凋亡，间质内可见淋巴细胞浸润(见图5)。

图5 pAd-iASPP-RNAi处理后裸鼠移植瘤细胞的变化(HE 200×)Fig 5 Changes of transplanted tumor cells in nude mice treated with pAd-iASPP-RNAi(HE 200×)

2.7 pAd-iASPP-RNAi处理后裸鼠移植瘤细胞凋亡和坏死的变化 裸鼠HT-29移植瘤模型经pAdiASPP-RNAi处理后，瘤细胞的凋亡率、坏死率升高，与阴性对照组、空载病毒对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.01，见图6)。

图6 pAd-iASPP-RNAi组、空载病毒对照组及阴性对照组移植瘤细胞的凋亡率、坏死率Fig 6 The percentage of apoptosis and necrosis of transplanted tumor cells in pAd-iASPP-RNAi group，empty virus control group and negative control group

3 讨论

结直肠癌是我国发病率最高的消化系统恶性肿瘤，近年来由于饮食结构及生活习惯等的影响，发病率显著上升，且逐渐出现低龄化现象，尽管临床采取了以手术为主的综合性治疗措施，取得了一定的效果，但结直肠癌患者在术后出现的原位复发、远处转移及耐药，在一定程度上影响了患者的生存质量、生存时间。如何筛选结直肠癌的分子靶标，把不同分子类型的结直肠癌患者进行分类并采取精准治疗，同时研发可能的分子免疫靶向治疗药物是目前临床需要解决的一个难题。

<1)，且各件产品是否为不合格品相互独立．

ASPP家族成员在精准调控p53蛋白的抑癌功能方面具有重要作用，是p53基因发挥生物学作用的下游基因［4-5］。ASPP蛋白及基因在多种肿瘤中均有异常表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌［6］、血液肿瘤［7］等，ASPP家族成员在这些肿瘤中存在ASPP1/2低表达，iASPP高表达的现象。有研究［8］显示，在结直肠癌组织中iASPP的表达显著高于癌旁组织。

作为抑制肿瘤细胞凋亡的基因，iASPP通过与ASPP1/ASPP2竞争性地结合p53蛋白从而抑制后者介导的细胞凋亡，iASPP也因此被称为癌基因。在多种肿瘤中，iASPP的过表达能显著增加肿瘤细胞的增殖活性、侵袭性，对放/化疗的耐受性，且预后较差。iASPP通过p53和/或非p53依赖的分子通路促进肿瘤的发生和浸润。我们的前期研究［9-10］显示，iASPP mRNA在乳腺癌细胞MCF-7中有过表达现象，而ASPP1/ASPP2的表达量相对较低，继而我们设计了针对iASPP基因的RNAi，通过腺病毒载体转染表达野生型p53基因的MCF-7细胞，结果显示，解除iASPP对p53基因的抑制后，乳腺癌细胞株的凋亡率显著增加。微小RNA-124也可直接作用于iASPP抑制肿瘤细胞的生长和侵袭［11］。在大肠癌细胞的研究中发现，iASPP在HT-29细胞株中存在过表达，对于表达突变型p53的大肠癌细胞株HT-29，如果阻断了iASPP的过表达后，对肿瘤细胞的凋亡会产生何种影响呢?

我们应用已构建的针对iASPP的RNAi，然后通过腺病毒载体感染AD-293细胞，获得具备感染能力的上清液，经3轮扩增后，在细胞沉积物中检测到插入片段，证实构建成功。将含有iASPP-RNAi的病毒液感染大肠癌细胞株HT-29后，经过RT-PCR和Westernblotting方法检测到iASPP基因在mRNA和蛋白质水平均显著降低，HT-29细胞的凋亡率也显著增加。在体外移植瘤模型中，局部注射含有iASPP-RNAi的病毒后，瘤细胞的凋亡率也显著增加，这些结果进一步提示，在大肠癌细胞中，干扰iASPP的表达后能够显著增加肿瘤细胞的凋亡。

iASPP的C末端域主要与p53的DNA核心区域临近的连接区域相结合，ASPP2和iASPP与p53的结合位点不同，iASPP与p53的连接区域结合后能够抑制ASPP2与p53的结合，即使ASPP2已经与p53结合时，也能够抑制ASPP2的生物学功能［12］。通过抑制iASPP在大肠癌细胞株HT-29中的表达能够显著增加瘤细胞的凋亡，为结直肠癌的分子免疫治疗提供理论基础，同时也有助于结直肠癌的分子分型。

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The influence of inhibitory member of the ASPP family(iASPP)on apoptosis of colorectal cancer cell

WANG Changsong1，FAN Naijun1，LV Xuexia1，YUN Tian1，MENG Nianlong1，YUAN Xutao1，LI Fulin1，WANG Zhicheng2
1.Department of Pathology，150 Central Hospital of PLA，Luoyang 471031;2.Department of Pathology，153 Central Hospital of PLA，China

ObjectiveTo investigate the effect of the iASPP RNAi on the apoptosis of colorectal cancer HT-29 cells.MethodsThe recombinant plasmid pAd-iASPP-RNAi was transfected into HT-29 cells.The cell apoptosis was detected by FCM.And then the HT-29 transplantation tumor cells in nude mice model was set up，the expressions of iASPP RNA and protein were detected by RT-PCR and Western blotting，the apoptosis index was detected by FCM.ResultsThe results showed that the expression of iASPP was descended in HT-29 cells and the apoptosis index was increased after transfection(P ＜0.01).In transplantation tumor model，the expression of iASPP was also descended，the apoptosis index was increased(P＜0.01).ConclusionThe inhibitory expression of iASPP increases the apoptosis of colorectal cancer cells in vivo and in vitro，iASPP may be a candidate target for molecular immunotherapy in colorectal cancer.

IASPP;HT-29 cells;RNAi;Apoptosis

R735.3+4

A

1006-5709(2017)08-0861-04

2017-05-31

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.006

洛阳市科技计划基金资助项目(1603003A-13)

王长松，副主任医师。E-mail:wangtmmu150@163.com

王志成，副主任技师，硕士，研究方向:肿瘤病理学。E-mail:15136263893@139.com