地皮菜多糖的分离纯化及结构组成分析

张雅雯，李海平，孟丽青，王迎进

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

地皮菜多糖的分离纯化及结构组成分析

张雅雯，李海平，孟丽青，王迎进*

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

以地皮菜为原料，采用水提醇沉法获得地皮菜多糖（Nostoc Commune polysaccharides，NCP），经Sevage法脱蛋白、DEAE-Sepharose CL-6B柱色谱法分离纯化、透析、冻干等制备地皮菜精制多糖。利用紫外和红外光谱对其进行纯度及结构分析，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生HPLC法测定其单糖组成及含量。结果表明：地皮菜多糖经DEAE-Sepharose CL-6B柱色谱分离可得到5种多糖组分，其主要组分NCP-3具有典型的多糖吸收峰。HPLC分析表明NCP-3主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖构成，其摩尔比为2.17∶7.14∶2.56∶1。

地皮菜，多糖；分离；结构表征；单糖

地皮菜（Nostoc Commune）又称地木耳、地软、地耳、地衣等，为念珠藻属植物[1-2]。地皮菜在我国各地几乎都有分布，资源极其丰富[3]。地皮菜含有丰富的蛋白质、多糖、维生素以及钙、铁、磷等，具有清热解毒、明目益气、补肾等功效[4]。已有研究表明多糖类成分作为地皮菜主要营养活性成分之一，具有明显的抗氧化、抑菌及保湿等作用[5]。因而有关地皮菜多糖的提取纯化、结构性质和药理作用的研究受到国内外学者的广泛关注[6]。目前，有关地皮菜多糖提取的研究不少[6]，但对地皮菜多糖的分离、纯化、结构组成分析研究报道很少[7]，且不够系统。为此，本文采用水提醇沉法获得地皮菜粗多糖，经Sevage法脱蛋白，DEAE-Sepharose CL-6B柱色谱分离得到5种多糖组分（NCP-1、NCP-2、NCP-3、NCP-4 和 NCP-5），然后重点对主要组分NCP-3进行纯度、结构及单糖组成分析，旨在为地皮菜多糖的开发利用和进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地皮菜：山西省五台县五台山；DEAE-Sepharose CL-6B：北京索莱宝科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）：国药集团化学试剂有限公司；鼠李糖（Rha，HPLC检测含量≥99%）：北京化学试剂公司；葡萄糖醛酸（GlcUA，含量≥98%）：西亚试剂公司；半乳糖醛酸（GalUA，含量≥97%）、葡萄糖（Glc，HPLC 检测含量≥99%）、甘露糖（Man，含量≥98%）、半乳糖（Gal，HPLC检测含量≥99.5%）、阿拉伯糖（Ara，含量≥98%）：南京都莱生物技术有限公司；乙腈为色谱纯；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器、FTIR 8400红外光谱仪、UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津；N-2000色谱工作站：浙江大学；BS-100A自动部分收集器：上海精密仪器有限公司；LGJ-10多歧管普通型冷冻干燥机：河南兄弟仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 地皮菜多糖的提取

地皮菜70℃干燥4 h，粉碎，过60目筛，称取地皮菜粉末100 g，95%乙醇600 mL搅拌回流2 h，抽滤，挥干。用石油醚（沸程60℃～90℃）600 mL搅拌回流2 h，抽滤，干燥得地皮菜药渣。称取地皮菜药渣50 g，以20倍量的蒸馏水在温度70℃下超声提取45 min，过滤，滤渣重提2次，合并滤液，减压浓缩。Sevage法脱蛋白、醇沉、过滤、洗涤、冷冻干燥得地皮菜粗多糖。

1.3.2 地皮菜多糖的分离纯化[8]

DEAE-Sepharose CL-6B层析柱（2.5 cm×60 cm）先用超纯水平衡，称取地皮菜粗多糖0.100 g，少量水溶解，上柱，依次用 H2O、0.1、0.3、0.5、1 mol/L 的 NaCl溶液各250 mL洗脱，流速为1 mL/min，自动收集器收集每管10 mL。以硫酸-苯酚法跟踪检测，以管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。由洗脱曲线可知，地皮菜粗多糖经DEAE-Sepharose CL-6B层析后，可得 5个组分，分别命名为 NCP-1、NCP-2、NCP-3、NCP-4和NCP-5，其中NCP-3组分含量远高于其它4个组分，故选取NCP-3作为主要分析对象。按峰形合并NCP-3组分峰洗脱液，超纯水透析48 h，浓缩，醇沉，离心，冻干。

1.3.3 NCP-3的紫外、红外光谱测定[10]

将NCP-3溶液配成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，在波长200 nm～400 nm范围内进行紫外光谱扫描。将NCP-3与KBr混合、研细压片，在400cm-1～4000cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.3.4 NCP-3的单糖组成

1.3.4.1 对照品溶液的制备

准确取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸各0.025 g、葡萄糖0.050 g、半乳糖0.030 g、阿拉伯糖0.030 g，用超纯水溶解定容到10 mL容量瓶中，摇匀。

1.3.4.2 NCP-3的水解

取NCP-3溶液5 mL于比色管中，加0.1 mL浓硫酸，充N2密封，120℃水解4 h，NaOH溶液中和，离心5 min得上清液。

1.3.4.3 对照品及NCP-3水解产物的衍生化标记

分别取对照品溶液和NCP-3水解产物各0.50 mL于5 mL离心管中，加入0.25 mol/LNaOH溶液0.5 mL，涡旋混匀。加入0.25 mol/L PMP甲醇溶液0.5 mL，混匀。70℃水浴反应70 min，冷水浴10 min，加0.25 mol/L HCl 0.5 mL中和，涡旋2 min，加1 mL氯仿萃取3次，将水相用0.45 μm微孔膜过滤后HPLC进样分析[11]。

1.3.4.4 色谱条件

色谱柱：Krmasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：35℃，流动相：20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.72）-乙腈（体积比为 78 ∶22）；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm。

2 结果与分析

2.1 地皮菜多糖的分离纯化

地皮菜多糖经DEAE-Sepharose CL-6B柱层析得洗脱曲线如图1所示。

图1 地皮菜多糖的DEAE-Sepharose CL-6B柱色谱分离Fig.1 Elution curve of NCP on DEAE-Sepharose CL-6B column

峰NCP-1为超纯水洗脱得到，峰NCP-2、NCP-3、NCP-4和NCP-5为NaCl溶液洗脱得到。其中NCP-3组分峰由0.3 mol/LNaCl洗脱得到，为地皮菜多糖的主要成分。经透析、醇沉、冻干得地皮菜精制多糖NCP-3。

2.2 NCP-3的紫外、红外光谱分析

图2-a为NCP-3的紫外光谱图，图2-b为NCP-3的红外光谱图。

图2 NCP-3的紫外光谱和红外光谱Fig.2 UVabsorptionspectrum（a）andRspectrum（b）ofNCP-3

由图2-a可以看出NCP-3的紫外光谱吸收曲线平滑，在波长260、280 nm附近无明显的吸收峰，说明NCP-3的纯度较高，不含核酸和蛋白质。由葡萄糖对照溶液制作标准曲线方程计算得其总多糖纯度达97.88%。由图2-b可知，NCP-3组分具有多糖典型的特征吸收峰。在3 600 cm-1～3 200 cm-1出现的强而宽的峰为糖类物质O-H的伸缩振动[12]，2 914.20 cm-1为烷基的C-H的伸缩振动，1 650.52 cm-1是羧基的C=O非对称伸缩振动，1 423.15 cm-1为COO-中的对称伸缩振动和COOH中的C-O伸缩振动[13]。1 065.09 cm-1处的强峰是吡喃糖环的醚键（C-O-C）和羟基的吸收峰，950 cm-1～1 200 cm-1的特征峰说明有C-O-C和C-OH存在。804.47 cm-1处有吸收峰，说明可能含有甘露糖。707.02 cm-1吸收峰是α-和β-吡喃单糖形成的特征[14]。

2.3 NCP-3的单糖组成

混合对照品和NCP-3水解产物PMP衍生物的分离效果见图3。

由图3可以看出，对照品7种成分和NCP-3水解产物的PMP衍生物均分离良好，NCP-3为主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖及阿拉伯糖组成的杂多糖。用单糖对照品溶液制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，按上述试验条件1.3.4进行衍生及色谱分析。以对照品各单糖的峰面积对进样量进行线性回归，x为质量（μg）；y为峰面积，得各单糖的回归方程、相关系数及线性范围，见表1。

图3 混合标准单糖（a）和NCP-3水解产物（b）的PMP衍生物HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of PMP derivatives of mixed standard monosaccharides（a）and NCP-3 hydrolysis products（b）

表1 5种单糖和2种糖醛酸的标准曲线Table 1 Regression equation and linear range of 5 monosaccharides，glucuronic acid and galacturonic acid

由NCP-3组分中各单糖的峰面积计算得NCP-3中单糖的摩尔比为甘露糖：葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶阿拉伯糖=1.68∶1.95∶4.2∶1。

3 结论

本试验通过水提醇沉法获得地皮菜粗多糖，经DEAE-Sepharose CL-6B柱分离可获得5种地皮菜多糖组分 NCP-1、NCP-2、ANCP-3、NCP-4、NCP-5。紫外光谱表明NCP-3经分离纯化后不含蛋白质及核酸；红外光谱表明NCP-3具有多糖的典型吸收峰。采用柱前衍生HPLC法测定了主要组分NCP-3的单糖组成，发现NCP-3为主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖等单糖组成的一种杂多糖。

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Separation，Purification and Structural Analysis of Polysaccharides from Nostoc Commune

ZHANG Ya-wen，LI Hai-ping，MENG Li-qing，WANG Ying-jin*
（Department of Chemistry，Xinzhou Normal University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The polysaccharides were extracted from Nostoc Commune with boiling water，followed by precipitation with ethanol，deproteinization with Sevage regent，and purification with DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The purity and their structure were analyzed by UV and FTIR spectroscopy，and the monosaccharide compositions were investigated by PMP pre-column derivatization HPLC.The result suggested that fiverefined polysaccharides fractions，named as NCP-1，NCP-2，NCP-3，NCP-4 and NCP-5，were obtained by DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The major component NCP-3 showed no signals of protein and nucleic acid and exhibited typical signals of polysaccharides.The NCP-3 was a hetero polysaccharides consisting of mannose，galacturonic acid，glucose and arabinose in a molar ratio of 2.17 ∶7.14 ∶2.56 ∶1.

Nostoc Commune；polysaccharides；separation；structural analysis；monosaccharide

2016-12-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.013

忻州师范学院青年科研资助项目（QN201411）；忻州师范学院大学生科技创新基金资助课题（201493）；忻州师范学院教学改革研究项目（JG201310）；忻州师范学院重点建设学科项目（XK201303）

张雅雯（1995—），女（汉），本科，主要从事食品化学研究。

*通信作者：王迎进（1980—），男，副教授，硕士，主要从事天然植物有效成分分离研究工作。