大孔吸附树脂分离石榴皮中安石榴苷工艺研究

刘迪，宋晓宇，李婧，尚华

（1.陕西工业职业技术学院化工与纺织服装学院，陕西咸阳712000；2.陕西海升果业发展股份有限公司，陕西西安710100）

大孔吸附树脂分离石榴皮中安石榴苷工艺研究

刘迪1，宋晓宇2，李婧1，尚华1

（1.陕西工业职业技术学院化工与纺织服装学院，陕西咸阳712000；2.陕西海升果业发展股份有限公司，陕西西安710100）

采用大孔吸附树脂分离石榴皮中安石榴苷。对比吸附率和解吸率，筛选大孔吸附树脂；考察梯度洗脱和等度洗脱分离纯化效果，选择分离方式；通过单因素试验，确定分离纯化参数。试验结果显示：选用LX-3010树脂在长径比为5∶1树脂柱中以等度洗脱方式分离纯化可以得到较高的安石榴苷提取量。单因素结果显示，树脂分离条件为：吸附液浓度2.0 mg/mL，吸附时间30 min，吸附流速1.5 mL/min；洗脱乙醇浓度40%，洗脱时间180 min，洗脱流速1.5 mL/min。在此条件下，可以得到纯度为80.12%的安石榴苷纯化产物。

石榴皮；安石榴苷；大孔吸附树脂；分离

石榴皮为石榴科植物石榴（Punica granatumL.）的皮，我国南北都有栽培，以江苏、河南等地较多，将其干燥后可入药，具有涩肠止泻、止血、驱虫之功效，常用于久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、带下、虫积腹痛[1-2]。然而，以石榴为原料的生产加工企业，石榴皮通常作为加工废料低价处理，并没有对这一宝贵资源进行再次加工利用。石榴果皮中含有多种功效成分，如鞣质、安石榴苷、石榴皮碱、伪石榴皮碱、异石榴皮碱、没食子酸等[3-6]。其中，安石榴苷（punicalagin）为石榴皮中主要活性成分，属于多酚类物质，分子式为C48H28O30，具有较强的抗氧化作用，在食品、日化、医药等领域具有广泛的应用[7-11]。

本研究以安石榴苷为分离目标，选用安全无毒的乙醇溶剂提取石榴皮中的安石榴苷，应用大孔吸附树脂[12-14]分离安石榴苷。考察不同型号树脂、不同洗脱方式对分离效果的影响，应用单因素试验确定树脂分离条件，以期为石榴皮深度加工和综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石榴皮粉：市场上购买陕西西安市临潼区石榴，洗净，去皮，置于50℃烘箱内烘干，粉碎过100目筛，封口袋封装后避光保存；安石榴苷标准品（含量＞98%，CAS编号65995-63-3）：成都曼思特生物科技有限公司；磷酸（优级纯）、乙腈（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；LX-620、LX-280、LX-1010、LX-3010 树脂：西安蓝晓科技新材料股份有限公司；40 mm×200 mm（长径比为5∶1）聚四氟活塞层析柱：天长市东宏实验仪器厂；试验用水为18.25 MΩ超纯水。

1.2 仪器与设备

FW100高速万能粉碎机：鹤壁市恒科仪器仪表有限公司；DHG-9030电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；RV8旋转蒸发仪：德国IKA公司；AL204型电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；BT100-1L恒流泵：兰格恒流泵有限公司；P230型高效液相色谱系统：大连依利特分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 安石榴苷粗提液的制备

取一定量石榴皮粉，与60%乙醇按照料液比为1 ∶25（g/mL）的比例混合，在 60℃条件下提取 6 h，抽滤两次，合并滤液，将滤液在50℃条件下旋转蒸发浓缩，制备不同浓度的安石榴苷粗提液，作为树脂上柱液使用。

1.3.2 安石榴苷测定

按照文献[15]所述高效液相色谱（HPLC）检测方法测定安石榴苷。色谱条件为：色谱柱为Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温 30℃，紫外检测器，波长378 nm，流动相为0.1%的磷酸水溶液（A液）和0.1%的磷酸乙腈溶液（B液），线性梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，进样量 10 μL。梯度洗脱程序：0～10 min 5%～40%B，10 min～20 min 40%～55%B，20 min～25 min 55%～60%B，25 min～30 min 60%～90%B，30 min～35 min 90%～5%B，35 min～45 min 5%B[15]。

1.3.3 树脂型号筛选试验

按照树脂产品说明书要求，对树脂进行预处理。取 LX-620、LX-280、LX-1010、LX-3010 树脂各 20 g，加入0.1 mg/mL安石榴苷粗提液30 mL，20℃振荡吸附12 h，抽滤，测定滤液安石榴苷浓度，计算各树脂吸附率；将过滤后的树脂分别用30 mL20%乙醇溶液在20℃振荡解吸12 h，抽滤，测定滤液安石榴苷浓度，计算各树脂解吸率。

1.3.4 洗脱方式选择试验

1.3.4.1 等度洗脱试验

树脂型号由1.3.3确定，取预处理好的树脂100mL，湿法装柱，将浓度为2.0 mg/mL安石榴苷粗提液分别以1 mL/min的速度流过树脂柱，吸附60 min，用水、20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液分别以1 mL/min的速度洗脱，每15 min收集一次洗脱液，HPLC法检测各洗脱液中安石榴苷浓度，确定各洗脱液的最佳洗脱时间并计算安石榴苷总提取量。每次洗脱完毕后，将树脂进行再生处理。

1.3.4.2 梯度洗脱试验

树脂型号由1.3.3确定，取预处理好的树脂100mL，湿法装柱，将浓度为2.0 mg/mL的安石榴苷粗提液以1 mL/min的速度流过树脂柱，吸附60 min，依次用水、20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液各200 mL以1 mL/min的速度洗脱，每15 min收集一次洗脱液，HPLC法检测各洗脱液中安石榴苷浓度，计算安石榴苷总提取量。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 树脂吸附单因素试验

依次考察吸附流速、吸附液浓度、吸附时间3个因素变化对安石榴苷吸附效果的影响，制备2.0 mg/mL安石榴苷粗提液，分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的速度流过树脂柱，吸附60 min；分别制备1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL不同浓度安石榴苷粗提液，分别以1 mL/min的速度流过树脂柱，吸附60 min；制备2.0 mg/mL安石榴苷粗提液，以1 mL/min的速度流过树脂柱，15、30、45、60、75 min 收集一次吸附后溶液。分别收集各单因素试验吸附后溶液，HPLC法测定安石榴苷浓度，计算吸附后溶液安石榴苷浓度或吸附率。

1.3.5.2 树脂洗脱单因素试验

按照1.3.5.1试验结果对安石榴粗提液进行吸附，依次考察洗脱流速、洗脱时间、乙醇浓度3个因素变化对安石榴苷洗脱效果的影响，用40%乙醇溶液，分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min 的速度流过树脂柱，洗脱180 min；用40%乙醇溶液，以1 mL/min的速度进行洗脱，分别洗脱 60、90、120、150、180、210 min；分别用水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液以1 mL/min流速进行洗脱，洗脱120 min。分别收集各单因素试验洗脱后溶液，HPLC法测定洗脱后溶液安石榴浓度，计算洗脱率。

1.3.6 数据处理

每项试验平行做3次，试验数据用均数±标准差（mean±S.D.）表示；高效液相色谱图数据用Sigmaplot 10.0软件处理和作图。

2 结果与分析

2.1 安石榴苷色谱分析

按照文献[15]所述方法，安石榴苷标准品和安石榴苷粗提物高效液相检测结果如图1和图2所示，图中α和β分别为安石榴苷有两种同分异构体。

图1 安石榴苷标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of punicalagin standard

图2 安石榴苷粗提物高效液相色谱图Fig.2 Chromatograms of punicalagin extract

2.2 树脂型号筛选结果

树脂型号筛选结果如图3所示。

由图3可以看出，LX-3010型号树脂的吸附率最高，达到83.68%；LX-280和LX-3010型号树脂的解吸率相当，分别为59.99%和59.36%。综合考虑吸附率和解吸率，选择LX-3010型号树脂作为分离纯化树脂。

2.3 洗脱方式选择试验结果

2.3.1 等度洗脱试验结果

等度洗脱试验结果如图4所示，色谱图为安石榴苷浓度最高时间段所收集洗脱液HPLC分析图。

图3 不同型号树脂对安石榴苷的吸附率和解析率Fig.3 Adsorption rate and desorption rate of different type resin on punicalagin

图4 等度洗脱试验结果Fig.4 The result of isocratic elution test

图4显示，不同洗脱液进行洗脱时，能够将安石榴苷洗脱浓度降到0.1 mg/mL的时间有所差异，水为150 min，20%乙醇为 555 min，40%乙醇为 150 min，60%、80%和100%乙醇均为180 min。各洗脱液HPLC色谱图显示，水、20%乙醇、40%乙醇和60%乙醇洗脱液中杂峰较少，其中水洗脱液安石榴苷浓度最低；80%乙醇和100%乙醇洗脱液中杂峰较多。

2.3.2 梯度洗脱试验结果

梯度洗脱试验结果如图5所示。

各洗脱液HPLC图谱显示，40%乙醇梯度洗脱液中杂峰最少，水和60%乙醇梯度洗脱液中杂峰最多，100%乙醇梯度洗脱液中安石榴苷峰面积最小，且在水、60%、80%、100%乙醇梯度洗脱液中，分别出现了一个较大的峰a，并随着乙醇浓度的增大，该峰的峰高越高。

图5 梯度洗脱试验结果Fig.5 The result of gradient elution test

2.3.3 不同洗脱方式安石榴苷提取量比较

不同洗脱方式安石榴苷提取量比较结果如图6所示。

图6 不同洗脱方式安石榴苷提取量Fig.6 Punicalagin extraction mass by different elution mode

由图可以看出，等度洗脱中，20%～100%乙醇洗脱液得到安石榴苷提取量相当，分别为160.25、164.10、163.98、162.87、162.99 mg，水洗脱得到的安石榴苷量最少，仅为14.17 mg；而梯度洗脱中，各洗脱液浓度结果显示，20%乙醇梯度洗脱液得到的安石榴苷浓度最高，其次为40%乙醇梯度洗脱液，浓度最低的为100%乙醇梯度洗脱液。总的安石榴苷提取量为158.04 mg，与每个等度洗脱液得到的安石榴苷量相当。

从安石榴苷提取总量考虑，等度洗脱纯化可以得到较多的安石榴苷，且梯度洗脱步骤较繁琐，操作费时，工业化操作成本较高，因此，选择等度洗脱为安石榴分离纯化操作方式。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 树脂吸附单因素试验

树脂单因素试验结果如图7所示。

图7 树脂吸附单因素试验结果Fig.7 The result of single-factor experiment for resin absorption

吸附流速单因素试验结果显示，流速在0.5mL/min～1.5 mL/min吸附率逐渐上升，当流速为1.5mL/min时，吸附率最大；流速在1.5 mL/min～3.0 mL/min吸附率逐渐降低。吸附液浓度单因素试验结果显示，吸附液浓度在1.0 mg/mL～2.0 mg/mL吸附率逐渐上升，当浓度为2.0 mg/mL时，吸附率最大；浓度大于2.0 mg/mL吸附率逐渐降低。吸附时间单因素试验结果显示，吸附30 min后的溶液中安石榴苷浓度变大，75 min时吸附后溶液与吸附前溶液浓度相当。综合分析，确定树脂吸附工艺条件为：吸附液浓度2.0 mg/mL，吸附时间30 min，吸附流速1.5 mL/min。

2.4.2 树脂洗脱单因素试验

树脂单因素试验结果如图8所示。

图8 树脂洗脱单因素试验结果Fig.8 The result of single-factor experiment for resin elution

洗脱流速单因素试验结果显示，流速在0.5mL/min～1.5 mL/min洗脱率逐渐上升，当流速为1.5 mL/min时，洗脱率最大；流速在1.5 mL/min～3.0 mL/min洗脱率逐渐降低。时间单因素试验结果显示，洗脱时间在60min～180 min洗脱率逐渐上升，当洗脱时间为180 min时，洗脱率最大，大于180 min时洗脱率基本没有变化。乙醇浓度单因素试验结果显示，乙醇浓度在0%～40%洗脱率逐渐上升，当浓度为40%时，洗脱率最大；浓度在40%～100%洗脱率逐渐降低。综合分析，确定树脂洗脱工艺条件为：洗脱乙醇浓度40%，洗脱时间180 min，洗脱流速1.5 mL/min。

在确定的大孔吸附树脂分离条件下，对分离后的安石榴苷产品浓缩、冻干，平行操作3次，HPLC测定其中安石榴苷含量平均值为80.12%。

3 结论

通过比较不同型号的大孔吸附树脂对安石榴苷的吸附率和解吸率，筛选大孔吸附树脂；对比等度洗脱和梯度洗脱两种洗脱效果，选择合适的洗脱方式；应用单因素试验，确定树脂吸附和洗脱条件。最后，确定大孔树脂分离安石榴苷工艺条件为：将LX-3010树脂装填在长径比为5∶1树脂柱内，制备安石榴苷浓度为2.0 mg/mL的石榴皮粗提物上柱液，在吸附时间30 min、吸附流速为1.5 mL/min的条件下进行吸附，再用40.00%乙醇，以1.5 mL/min洗脱流速进行洗脱，洗脱180.00 min。在此工艺条件下，可以得到纯度为80.12%的安石榴苷纯化产物。本研究得到的最优工艺路线，可为石榴皮中安石榴苷的分离纯化提供技术支持，也为石榴皮的综合利用提供参考。

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Study on Processing of Separation for Punicalagin from Pomegranate Husk by Macroporous Adsorption Resin

LIU Di1，SONG Xiao-yu2，LI Jing1，SHANG Hua1
（1.Department of Chemical Engineering and Textile，Shaanxi Polytechnic Institute，Xianyang 712000，Shaanxi，China；2.Shaanxi Haisheng Fresh Fruit Juice Co.，Ltd.，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

Macroporous adsorption resin was used to separate punicalagin from pomegranate husk.By comparing the adsorption rate and desorption rate，the macroporous adsorption resin was screened；by investigating gradient elution and isocratic elution on effect of separation and purification，separation mode was chosen；by using single-factor test，the parameters for separation confirmed.The result showed that the more punicalagin could be gotten by using LX-3010 resin in column of which the ratio of length to diameter was 5∶1 by isocratic elution.Single-factor test result showed the optimization condition for separation was：the content，the time，and the flow rate for adsorption were 2.0 mg/mL，30 min，and 1.5 mL/min；the content of ethnol，the time，and the flow rate for elution were 40%，180 min，and 1.5 mL/min，respectively.The punicalagin with purity of 80.12%was achieved under the condition.This processing could be a reference for comprehensive utilization of pomegranate husk.

pomegranate husk；punicalagin；macroporous adsorption resin；separation

2016-12-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.010

陕西省科技厅工业科技攻关项目（2015GY165）

刘迪（1980—），女（汉），副教授，博士，研究方向：化学新材料的制备，天然产物研究与开发。