HPV16阳性和阴性患者宫颈癌组织中miR-27a-3p和HOXB8蛋白的表达差异及其机制研究

李会影，王慧智，张子旸（牡丹江医学院附属红旗医院妇产科，黑龙江牡丹江 157011）

·精准医疗·

HPV16阳性和阴性患者宫颈癌组织中miR-27a-3p和HOXB8蛋白的表达差异及其机制研究

李会影＊，王慧智，张子旸#（牡丹江医学院附属红旗医院妇产科，黑龙江牡丹江 157011）

目的：探讨miR-27a-3p和同源盒B8（HOXB8）蛋白在人乳头瘤病毒16型阳性[HPV16（+）]和阴性[HPV16（－）]患者宫颈癌组织中表达的差异及其机制。方法：选取2012年1月－2016年1月于我院就诊的宫颈癌患者120例，根据其是否感染HPV16分为HPV16（+）组（60例）和HPV16（－）组（60例）。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表达水平，采用蛋白印迹法检测HOXB8蛋白的表达水平，采用巢式降落式甲基化特异性聚合酶链反应法检测miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平，采用染色质免疫共沉淀-定量聚合酶链反应法检测miR-27a-3p启动子区组蛋白甲基化水平；培养人宫颈癌细胞系SiHa细胞株，考察转染miR-27a-3p模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）后miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表达水平。结果：HPV16（+）组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p的表达水平显著低于HPV16（－）组患者，HOXB8 mRNA和蛋白表达水平、miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平和组蛋白甲基化水平均显著高于HPV16（－）组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。在SiHa细胞转染miR-27a-3p mimic后，miR-27a-3p的表达水平显著升高，而HOXB8 mRNA的表达水平显著降低；转染miR-27a-3p inhibitor后，miR-27a-3p的表达水平显著降低，而HOXB8 mRNA的表达水平则显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论：HPV16可能通过启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化下调miR-27a-3p的表达，从而影响宫颈癌的发生与发展，HOXB8蛋白可能是其作用靶点。

人乳头瘤病毒16型；宫颈癌；miR-27a-3p；同源盒B8蛋白；DNA甲基化；组蛋白甲基化

宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤，在世界范围内的发病率和病死率均较高，严重威胁女性生命健康[1-2]。人乳头瘤病毒16型（Human papilloma virus type 16，HPV16）是最普遍、最致命的HPV类型之一，也是诱发宫颈癌的主要原因[3]。同源盒B8（Homeobox B8，HOXB8）是HOX蛋白家族成员，其表达水平在HPV16阳性[HPV16（+）]宫颈癌组织中显著升高，但具体机制尚未阐明[4]。微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类内源性小分子非编码RNA，可在转录后调控基因的表达[5]。研究表明，多种miRNAs通过调控靶基因的表达参与宫颈癌的发生与发展，其中miR-27a-3p可调控HOXB8基因的表达[6-8]。现有研究多集中于miRNAs的调控作用，而忽视了miRNAs表达变化的机制。DNA甲基化和组蛋白甲基化是表观遗传学调控的重要方式[9-10]，其是否参与miRNAs的表达调控仍不清楚。因此，本研究以HPV16（+）和HPV16阴性[HPV16（－）]宫颈癌患者为研究对象，探讨miR-27a-3p的表达变化及其机制，并考察其对HOXB8蛋白是否具有调控作用。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 QuantStudio Q3型实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）；Mastercycler Nexus Eco型普通PCR仪、547R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Powerpac HV Power Supply型电泳仪（美国BioRad公司）；FCM型凝胶成像系统（美国Protein Simple公司）；DLHR-D1603型电动匀浆器（华邻科技有限公司）；HR900-ⅡA2型生物安全柜（海尔生物医疗）。

1.1.2 试剂 胎牛血清（FBS）、opti-MEM无血清培养基、青链霉素和高糖培养基（DMEM）（美国Gibco公司，批号分别为12483-012、51985042、15240-062、12491-015）；磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Hyclone公司，批号：SH30256.01B）；聚山梨酯20（美国BioRad公司，批号：170-6531）；DNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（含SYBR Green、ddH2O）（美国Qiagen公司，批号分别为69506、74104、204054）；逆转录试剂盒及发光液（美国ThermoFisher公司，批号分别为K1691、32106）；DNA甲基化修饰试剂盒（北京天漠科技开发有限公司，批号：D5030）；miRNA提取试剂盒、miRNA逆转录试剂盒、miRNA荧光定量PCR试剂盒、miR-27a-3p及U6引物（天根生化科技有限公司，批号分别为DP501、KR201-02、FP401-02、CD201-0025、CD201-0145）；蛋白质提取及定量试剂盒、蛋白上样缓冲液（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号分别为KGP250、KGPBCA、KGP101）；anti-HOXB8、anti-H3K9me2（美国Abcam公司，批号分别为ab125727、ab120）；anti-β-actin及辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为TA-09、SC-2048）；人工合成miR-27a-3p模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）及阴性对照（上海吉玛制药技术有限公司）；Lipo2000（美国Invitrogen公司，批号：11668027）；染色质免疫共沉淀试剂盒[含蛋白A/G琼脂糖（Protein G Agarose），美国Millipore公司，批号：17-371]；普通引物由华大基因提供，HOXB8、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物及甲基化特异性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人宫颈癌细胞系Si-Ha细胞株购自美国模式培养物集存库。

1.2 研究对象

纳入标准：（1）于我院首次就诊或接受治疗的宫颈癌患者，经组织活检及术后病理学检查确诊为宫颈癌；（2）既往无其他恶性肿瘤病史；（3）不合并其他恶性肿瘤；（4）术前未接受放疗、化疗或其他治疗。排除标准：（1）年龄≤18岁者；（2）妊娠期妇女；（3）严重的肝肾功能障碍者；（4）合并不能有效控制的高血压、糖尿病及心脏疾病等。本研究方案经医院医学伦理委员会审核通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

本研究共纳入2012年1月—2016年1月于我院妇产科就诊的宫颈癌患者120例，根据其是否感染HPV16分为HPV16（+）组和HPV16（－）组。其中，HPV16（+）组患者60例，年龄28～63岁，平均年龄（47.2±9.5）岁；HPV16（－）组患者60例，年龄25～59岁，平均年龄（45.7±8.3）岁。所有患者均留取手术切除的癌组织标本，于－80℃冻存，备用。

1.3 研究方法

1.3.1 实时荧光定量PCR法检测miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表达水平 按照试剂盒说明书提取宫颈癌组织中的总miRNA和总mRNA，并将其逆转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）。其中，总miRNA的逆转录分为加多聚腺苷酸（PolyA）尾和逆转录两部分。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析，反应体系包括cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green 12.5 μL，ddH2O 8.9 μL，共25 μL。反应条件：95℃预变性5 min，1个循环；95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；产物经熔解曲线分析。HOXB8基因上游引物：5′-GTCCCTGCGCCCCAATTATTA-3′，下游引物：5′-GCCCGTGGTAGAACTCCTG-3′。HOXB8 mRNA相对表达水平以GAPDH的表达水平为参照，根据目的基因的相对表达量＝2－ΔΔCt计算结果，ΔΔCt＝[CtHOXB8－CtGAPDH]，计算HOXB8 mRNA的相对表达变化。miR-27a-3p相对表达水平以U6的表达水平为参照，根据目的基因的相对表达量＝2－ΔΔCt计算结果，ΔΔCt＝[CtmiR-27a-3p－CtU6]，计算miR-27a-3p的相对表达变化。式中，Ct（Cycle threshold）表示每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

1.3.2 蛋白质印迹（Western blotting）法检测HOXB8蛋白的表达水平 将宫颈癌组织剪碎，冰上匀浆，以离心半径6 cm、转速5 000 r/min离心5 min，弃去上清，收集沉淀。按照蛋白提取试剂盒说明书提取宫颈癌组织的总蛋白，并进行蛋白定量。按体积比1∶4加入蛋白上样缓冲液混匀，于100℃下反应5 min，使蛋白变性。取变性后的蛋白样品5 μL，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，切取大小约为32 kDa（HOXB8）和43 kDa（β-actin）的片段，分别进行半干转膜操作。转膜结束后，采用5%脱脂奶粉对聚偏二氟乙烯膜（PVDF）封闭2 h。分别与anti-HOXB8和anti-β-actin混合后，于4℃下孵育过夜。用磷酸缓冲盐溶液-聚山梨酯（PBST，由PBS和聚山梨酯20配制）洗膜后，与HRP标记的二抗于室温下孵育2 h，PBST洗膜后加发光液，于凝胶成像分析仪上成像并分析条带灰度值。以β-actin的表达量为参照，计算HOXB8蛋白的相对表达水平。HOXB8蛋白的相对表达水平＝HOXB8灰度值/βactin灰度值。

1.3.3 巢式降落式甲基化特异性PCR（nMS-PCR）法检测miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平 按照试剂盒说明书提取宫颈癌组织的基因组DNA，并采用亚硫酸氢盐法对基因组DNA进行甲基化修饰。在Ensembl Genome Browser（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）中查找miR-27a-3p启动子区序列并线上设计1对外引物和2对内引物（即甲基化引物和非甲基化引物）。外引物上游：5′-GGTTTTGTGTAGGGGAAATTTTATAG-3′，外引物下游：5′-CAACCCTATCCCCTTAAAATCTAAA-3′；甲基化引物上游：5′-TTGGGGTGAGATTATTTTTTTATTC-3′，甲基化引物下游：5′-CTAAAACCTAACTATACCCTCCGTT-3′；非甲基化引物上游：5′-GGGGTGAGATTATTTTTTTATTTGT-3′，非甲基化引物下游：5′-CTAAAACCTAACTATACCC-TCCATT-3′。外引物扩增的反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，20个循环，每个循环降0.5℃至52℃，72℃再延伸7 min。以外引物的PCR产物为模板，继续进行内引物的扩增，其扩增反应条件同外引物。取PCR产物5 μL于2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，并于凝胶成像分析系统成像，计算甲基化条带及非甲基化条带的光密度（OD），miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平＝甲基化条带的OD值/（甲基化条带的OD值+非甲基化条带的OD值）。

1.3.4 染色质免疫共沉淀-定量PCR（CHIP-qPCR）法检测miR-27a-3p启动子区组蛋白甲基化水平 将宫颈癌组织冰上匀浆后，以终体积分数为1%的甲醛室温固定10 min。采用终浓度为0.125 mol/L甘氨酸作用5 min以终止交联。以离心半径6 cm、转速5 000 r/min离心5 min后，弃去上清，PBS冲洗2遍。SDS裂解液重悬并裂解组织沉淀，冰上进行超声破碎操作，使DNA破碎为100～1 000 bp大小的片段。以离心半径6 cm、转速12 000 r/min离心15 min后取上清液100 μL，加入anti-H3K9me2抗体，于4℃下孵育过夜，形成anti-H3K9me2-H3K9me2复合物；经蛋白A/G琼脂糖结合沉淀后，形成Protein G Agarose-anti-H3K9me2-H3K9me2复合物，于65℃水浴中解除交联，并采用DNA提取试剂盒、按说明书操作纯化DNA，以纯化后的DNA为模板，对miR-27a-3p启动子区进行实时荧光定量PCR扩增反应。扩增反应体系及反应条件同“1.3.1”项，退火温度为59℃。

1.3.5 细胞培养及转染 用含10%FBS及1%抗生素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养SiHa细胞株。按每孔1×106个细胞铺板：①取100 μL opti-MEM与适量Lipo2000混匀静置5 min；②另取100 μL opti-MEM与适量miR-27a-3p mimic、inhibitor或阴性对照混匀静置5 min；③将上述①②混匀后静置20 min，加至细胞培养液中，于48 h后收集细胞，提取RNA进行后续试验，步骤同“1.3.1”项。

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用Students’t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p表达水平比较

HPV16（+）组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p的表达水平显著低于HPV16（－）组，差异有统计学意义（P＜0.01），详见图1。

2.2 两组患者宫颈癌组织中HOXB8 mRNA和蛋白表达水平比较

图1 两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p表达水平比较Fig 1 Comparison of the expression of miR-27a-3p in cervical cancer tissue between 2 groups

HPV16（+）组患者宫颈癌组织中HOXB8 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于HPV16（－）组患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见图2。

2.3 两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平比较

图2 两组患者宫颈癌组织中HOXB8 mRNA和蛋白表达水平比较Fig 2 Comparison of the expression of HOXB8 mRNA and protein in cervical cancer tissues between 2 groups

在线（http：//www.urogene.org/methprimer/）查看miR-27a-3p启动子区CpG位点和CpG岛分布情况，结果显示，miR-27a-3p启动子区富含CpG岛，详见图3。

HPV16（+）组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平显著高于HPV16（－）组患者，差异有统计学意义（P＜0.01），详见图4、图5。

图3 miR-27a-3p启动子区CpG位点和CpG岛分布情况Fig 3 Distribution of CpG islands and CpG sites in miR-27a-3p promoter region

2.4 两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区组蛋白甲基化水平比较

图4 nMS-PCR产物电泳图Fig 4 Electrophoretogram of nMS-PCR product

图5 两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区DNA甲基化水平比较Fig 5 Comparison of DNA methylation levels of miR-27a-3p promoter region in cervical cancer tissues between 2 groups

HPV16（+）组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区组蛋白甲基化水平显著高于HPV16（－）组患者，差异有统计学意义（P＜0.05），详见图6。

2.5 miR-27a-3p对HOXB8表达的影响

在人宫颈癌细胞系SiHa细胞株中分别转染miR-27a-3p mimic和inhibitor后，检测miR-27a-3p和HOXB8 mRNA表达的变化。结果显示，在SiHa细胞转染miR-27a-3p mimic后，miR-27a-3p的表达水平显著升高，而HOXB8 mRNA的表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；转染miR-27a-3p inhibitor后，miR-27a-3p的表达水平显著降低，而HOXB8 mRNA的表达水平则显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01），详见图7。

图6 两组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区组蛋白甲基化水平比较Fig 6 Comparison of histone methylation levels of miR-27a-3p promoter region in cervical cancer tissues between 2 groups

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤，HPV感染是引起宫颈癌的主要原因之一。HPV是一种双链DNA病毒，低危险性HPV可引起良性的生殖器疣，而高危险性HPV与宫颈癌的发生与发展密切相关。其中，HPV16是HPV最常见的类型，是导致宫颈癌的重要因素[3，11-12]。本研究以HPV16（+）和HPV16（－）宫颈癌患者为研究对象，初步探讨HPV16的致病机制。

图7 miR-27a-3p对HOXB8表达的影响Fig 7 Effect of miR-27a-3p on the expression of HOXB8

3.1 HOXB8与miRNAs

HOXB8是同源盒家族成员，能够编码具有HOX DNA结合结构域的核蛋白。研究表明，HOXB8与结直肠癌、胃癌和宫颈癌的发生、发展密切相关[4，13-14]。本研究结果显示，在HPV16（+）宫颈癌患者组织中HOXB8的表达水平显著升高，与文献[4]报道一致，但其具体机制尚不清楚。miRNAs是一类大小约为18～22个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，可通过结合靶mRNA 3′-非翻译（UTR）区使其降解或翻译一致，从而实现在转录后调控基因表达的目的。Yang H等[15]研究发现，miR-497可靶向转酮酶调控宫颈癌对铂化疗的敏感性；Zhou N等[16]研究发现，miR-138可通过调控人端粒逆转录酶（hTERT）的表达水平抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭；Lai XJ等[17]研究表明，miR-421可通过下调Bcl-xL从而介导c-33a宫颈癌细胞的凋亡，这提示多种miRNAs可通过调控靶基因的表达参与宫颈癌的发生与发展。本研究结果显示，在人宫颈癌细胞系SiHa细胞株中，转染miR-27a-3p mimic（即过表达miR-27a-3p）后，HOXB8 mRNA的表达水平显著降低；而转染miR-27a-3p inhibitor（即抑制miR-27a-3p的表达）后，HOXB8 mRNA的表达水平显著升高，提示miR-27a-3p可能直接或间接靶向调控HOXB8的表达，但具体机制尚有待进一步研究。

3.2 miRNAs与表观遗传学修饰

以往研究多集中于miRNAs对其靶基因的调控作用，而忽视了miRNAs表达变化的机制。表观遗传学修饰是指在基因核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达发生可逆、可遗传的改变。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白甲基化（Histone methylation）、基因组印记（Genomic imprinting）、母体效应（Maternal effects）、基因沉默（Gene silencing）、核仁显性、休眠转座子启动和RNA编辑（RNAediting）等[18]。其中，DNA甲基化和组蛋白甲基化是表观遗传学调控的重要方式，文献报道DNA甲基化和H3K9me2均为基因沉默的标志，且二者可能具有协同调控基因表达的作用[9，19]。赵丽等[20]研究表明，miR-124启动子区DNA甲基化在动脉粥样硬化的发生与发展过程中发挥了重要的作用。然而，DNA甲基化和组蛋白甲基化是否参与HPV16（+）宫颈癌组织miR-27a-3p的表达调控仍不清楚。本研究结果显示，HPV16（+）组患者宫颈癌组织中miR-27a-3p启动子区DNA和组蛋白甲基化水平均显著高于HPV16（－）组患者，提示DNA甲基化和组蛋白甲基化参与了HPV16（+）宫颈癌组织中miR-27a-3p的表达调控。DNA甲基化和组蛋白甲基化的发生需要相应酶的催化，如DNA甲基转移酶1（DNMT1）、组蛋白甲基化酶G9a等，但其在HPV16（+）宫颈癌中是否发生改变尚需进一步研究。

综上所述，HPV16可能通过启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化下调miR-27a-3p的表达，从而影响宫颈癌的发生与发展；HOXB8蛋白可能是其作用靶点，HOXB8基因可能是miR-27a-3p的靶基因。本研究为HPV16（+）宫颈癌患者的临床治疗提供了理论基础和治疗靶点。但miR-27a-3p启动子区发生DNA甲基化和组蛋白甲基化的机制仍不明确，还需后续深入研究。

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（编辑：张元媛）

Expression Difference and Its Mechanism Study of miR-27a-3p and HOXB8 Protein in Cervical Cancer Tissues of HPV16-positive and HPV16-negative Patients

LI Huiying，WANG Huizhi，ZHANG Ziyang（Dept.of Obstetrics and Gynecology，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Heilongjiang Mudanjiang 157011，China）

OBJECTIVE：To investigate the expression difference and its mechanism of miR-27a-3p and HOXB8 protein in cervical cancer tissues of HPV16-positive and HPV16-negative patients.METHODS：A total of 120 patients with cervical cancer in our hospital during Jan.2012-Jan.2016 were divided into HPV16-positive group（60 cases）and HPV16-negative group（60 cases）according to HPV16 infection situation.The expression of miR-27a-3p mRNA and HOXB8 mRNA in cervical cancer tissue were detected by RT-qPCR.The expression of HOXB8 protein was detected by Western blotting assay.DNA methylation level of miR-27a-3p promoter region was detected by nested-down methylation specific PCR（nMS-PCR）.Histone methylation level of miR-27a-3p promoter region was detected by chromatin immunoprecipitation PCR（CHIP-PCR）.The expression of miR-27a-3p mRNA and HOXB8 mRNA were detected after transfecting miR-27a-3p mimic and inhibitor into Human cervical cancer cell line SiHa，respectively.RESULTS：The expression of miR-27a-3p in HPV16-positive group was significantly lower than HPV16-negative group，while HOXB8 mRNA and protein expression，DNA and histone methylation levels of miR-27a-3p promoter region were significantly higher than HPV16-negative group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.After transfecting miR-27a-3p mimic into SiHa cells，the expression of miR-27a-3p was increased significantly，while that of HOXB8 mRNA was decreased significantly；after miR-27a-3p inhibitor transfection，the expression of miR-27a-3p was decreased significantly，while that of HOXB8 mRNA was increased significantly，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：HPV16 may down-regulate the expression of miR-27a-3p through DNA methylation and histone methylation of promoter region，so as to influence the generation and development of cervical cancer.HOXB8 may be the target protein of miR-27a-3p.

Human papilloma virus type 16；Cervical cancer；miR-27a-3p；Homeobox B8 protein；DNA methylation；Histone methylation

R711.74

A

1001-0408（2017）23-3169-06

2016-12-22

2017-06-15）

＊副主任医师，硕士。研究方向：妇产科学。电话：0453-6602036。E-mail：huiying26@163.com

#通信作者：副主任医师。研究方向：妇产科学。电话：0453-6602036。E-mail：1403355759@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.23.01