黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻细胞质膜透性的影响

陈国元，李青松，何彩庆

（厦门理工学院环境科学与工程学院，福建 厦门 361024）

0 引言

近几十年来，水体富营养化及藻类水华已成为一个世界性环境问题。水生植物化感抑藻作用的发现使其开始应用于富营养化水体藻类控制领域，并已成为世界环境研究的热点和前沿[1]。现在，许多植物的浸提液和提取物都发现对藻类生长具有很好的抑制作用[2-5]，并从中分离到具有很好抑藻效果的化感物质[6]，为藻类水华控制提供了新的思路和材料。作者在前期的研究中，发现具有很好氮、磷去除能力的挺水景观植物-黄菖蒲(Iris pseudacorus L)[7]能对藻类生长产生严重影响[8]，已从黄菖蒲水浸提液中鉴定出15种脂肪酸类物质和9种酚酸类物质，并进一步研究表明，这些有机酸成分能够明显抑制铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，引起细胞的氧化损伤，促进叶绿素的分解[9]。

本实验继续以黄菖蒲为材料，采用液液萃取的方法得到黄菖蒲水浸提液的有机酸组分，研究其对铜绿微囊藻细胞质膜透性的影响，具体包括细胞内超氧阴离子自由基(O2-·)的产生，K+、可溶性蛋白及核酸渗出量，非电解质外渗率及藻液电导率等，旨在探讨黄菖蒲有机酸组分化感作用下，铜绿微囊藻细胞膜系统的变化，为进一步阐明黄菖蒲有机酸组分的化感抑藻机制提供理论依据，以期最终为将其应用到富营养化水体水华防治中提供有价值的研究资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄菖蒲购至福建省龙海市兴涛花木专业合作社。铜绿微囊藻(FACHB-905)由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，先用BG-11培养液于MGC-450BPY-2智能型光照培养箱中进行扩大培养，培养条件为：恒温光照(25±1℃，3000lx)，明、暗比 12h/12h。然后取适量藻液，3 000 r/min离心10 min，去掉上清液，获得铜绿微囊藻细胞，加入新鲜的高温灭菌的BG11培养基培养6d，使之处于对数生长期。

1.2 有机酸组分的获得

黄菖蒲洗净、晾干、粉碎，室温下60.0 g粉末用1 L超纯水浸提48 h，滤纸滤去提取液中的残渣后经0.45 μm Whatman GF/C玻璃纤维膜抽滤，滤液用2 mol/L的NaOH调节pH值到12，以6 000 r/min离心10 min，上清液移至分液漏斗，色谱纯正己烷萃取3次，收集水相用2 mol/L的HCl调节pH值至2，乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯组分，无水硫酸钠干燥，35℃下旋转蒸发去除溶剂，获得浸膏58.6 mg，4℃保存备用。

1.3 实验设计

分别称取适量浸膏，加入二甲亚砜（DMSO）溶解，加入高温灭菌的BG11培养基，使DMSO体积分数为0.05%[10]，随后接入处于对数生长期的铜绿微囊藻，接种密度约为5×106个/mL，浸膏最终质量浓度分别为2，20和50 mg/L。同时设定不添加浸膏的BG11培养基培养铜绿微囊藻为对照组。每组设定3个平行。培养瓶置于MGC-450BPY-2智能型光照培养箱中。第 1，3，5 天取样，测定藻液电导率(EC)、非电解质外渗量、可溶性蛋白质及核酸渗出量和铜绿微囊藻细胞内含量。

对K+释放的影响：首先取适量浸膏，加入DMSO溶解后加入生理盐水分别配制成质量浓度4，40和100 mg/L的浸膏溶液。然后取扩大培养后的铜绿微囊藻，加入高温灭菌的BG11培养基使铜绿微囊藻密度约为1.0×107个/mL，取藻液10 mL于15 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，去掉上清液，加入10 mL生理盐水，轻轻摇匀后离心，获得铜绿微囊藻细胞，共制备15管。3管中加入10 mL生理盐水作为对照，其它9管中分别加入5 mL生理盐水和5 mL浸膏溶液，使有机酸组分质量浓度分别为2，20和50 mg/L，摇匀后置于MGC-450BPY-2智能型光照培养箱中，3 d后取样测定藻液中K+浓度。最后3管加入10 mL生理盐水,100℃水浴10 min,3 000 r/min离心10 min，上清液用于测定K+浓度,表示细胞膜完全破坏后K+渗出总量[11]。

1.4 测定方法

取藻液15 mL，3 000 r/min离心10 min后，获得上清液和藻细胞。取上清液进行下列参数测定：电导率(EC)采用台式电导率仪(优特CON 510)测定；非电解质外渗量采用紫外吸收法[12]，用UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津)测定,以OD264值表示；藻可溶性蛋白质和核酸渗出量分别用OD280[13]和OD260值[14]表示。藻细胞中O2-·的产生情况参照萧华山等[15]的方法测定，以OD530值表示其相对含量。K+浓度在上清液经0.2 μm玻璃纤维滤膜过滤后采用AA-6300C型火焰原子吸收分光光度计(日本岛津)测定。

1.5 数据处理与统计

运用SPSS10.0软件及Sigmaplot10.0软件对数据进行统计分析和计算。

2 结果与讨论

2.1 黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻细胞内O2-·的影响

不同浓度黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻细胞内O2-·含量的影响见图1。

图1 不同浓度黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻细胞内O2-·质量浓度的影响

由图1可知，有机酸质量浓度为2 mg/L时，藻细胞中O2-·含量在培养过程中与对照组没有显著性差异（配对t检验，p＞0.05）；而有机酸质量浓度为20mg/L时，培养第3天，藻细胞中O2-·含量明显上升，为初始值的2.38倍，第5天进一步增加，为初始值的4.03倍，显著高于对照组（配对t检验，p＜0.05）；有机酸质量浓度为50 mg/L时，藻细胞中含量在培养过程中也是显著高于对照组（配对t检验，p＜0.05），在第3天和第5天分别为初始值的5.06和7.78倍，说明随着有机酸的增加，培养时间延长，有机酸组分对铜绿微囊藻产生了严重的氧化胁迫。已有大量研究表明，有机酸类物质是非常重要的一类化感抑藻物质[16-21]。如适量的焦性没食子酸、乳酸等都能对铜绿微囊藻产生氧化胁迫，导致藻细胞内含量上升[18-19]。而作者在前期研究中，已从黄菖蒲水浸提液中鉴定出15种脂肪酸类物质和9种酚酸类物质[9]，其中包括了已被证明具有化感抑藻活性的琥珀酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、辛酸、葵酸、月桂酸、软脂酸、硬脂酸、丁酸、油酸和戊酸等[10,16,22]。这些有机酸类物质可引起藻细胞内O2-·的产生，但是浓度较低的时候，自由基的产生与消除之间处于动态平衡状态，而随着有机酸浓度的增加，培养时间延长，有机酸组分对铜绿微囊藻的氧化胁迫加重，O2-·的产生与清除失去平衡，导致O2-·积累。

2.2 黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻培养液EC及K+渗出的影响

细胞膜通透性的存在，对细胞内外各种物质的交换，渗透压的维持，胞内环境的相对稳定等均有着重要的生理意义。胁迫环境下，细胞质膜一般最先受到破坏，其结构和功能发生变化，细胞内小分子物质外渗，EC增加[19,23]。因此，细胞膜的通透性可以用EC表示，见图2。

图2 不同质量浓度黄菖蒲有机酸对铜绿微囊藻培养液EC的影响

由图2可知，对照组和有机酸质量浓度为2 mg/L组，EC值都略有降低，第5天分别为初始值的83.9%和87.3%。而有机酸质量浓度为20 mg/L时，培养第3天，EC值略有上升，为初始值的1.07倍，第5天明显上升，为初始值的1.26倍；有机酸组分为50 mg/L时，培养第3天，EC值明显上升，为初始值的1.28倍，第5天继续增加，为初始值的1.40倍，这主要是因为，藻细胞内积累的O2-·又可以转化成H2O2和OH·，这些自由基很容易与细胞膜成分、核酸、蛋白质等物质反应，导致细胞脂质过氧化，膜结构受到破坏、膜透性发生变化[24]。

K+是外渗液中电解质的主要成分，因此K+含量可以用来衡量细胞膜损伤的程度[12],见图3。

图3 不同质量浓度黄菖蒲有机酸对铜绿微囊藻胞内K+释放的影响

由图3可知，黄菖蒲有机酸质量浓度为2，20和50 mg/L时，藻液中K+质量浓度分别为4.73，6.89和9.49 μg/L，分别为对照组的 1.14，1.66 和 2.28 倍，说明高浓度黄菖蒲有机酸组分处理后，铜绿微囊藻细胞膜的选择透性被破坏，离子的渗出量大量增加。当藻细胞完全破坏时，藻细胞中K+全部释放，质量浓度为10.15 μg/L，因此，黄菖蒲有机酸质量浓度为50 mg/L时，藻细胞中K+释放程度达到了93.5%，表明，此时铜绿微囊藻细胞膜的选择透性已经被严重破坏，藻细胞膜损伤非常严重。李锋民等[11]研究了2-甲基乙酰乙酸乙酯（EMA）对铜绿微囊藻细胞膜选择透性的影响，结果表明，高浓度(ρ＞1 mg/L)的EMA能显著增加铜绿微囊藻内K+的渗出量。而K+的大量渗出导致藻细胞内K+的缺乏，从而引起细胞其它生理功能的改变，如胞内的离子平衡、光合作用及细胞生长等[25]，从而恶性循环，加剧对藻细胞的伤害。

2.3 黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻OD264的影响

藻的细胞质膜通透性增大的时候，除了电解质会渗出外，细胞内有机物也会大量渗出，导致藻培养液中的非电解质含量短时间内急剧增高[12]。见图4。

图4 不同质量浓度黄菖蒲有机酸对铜绿微囊藻OD264的影响

由图4可知,有机酸质量浓度为2 mg/L时，在培养过程中藻细胞OD264与对照组没有显著性差异（配对t检验，p＞0.05）；而有机酸质量浓度为20 mg/L时，培养第3天，藻细胞OD264明显上升，为初始值的1.70倍，第5天进一步增加，为初始值的2.66倍，显著高于对照组（配对t检验，p＜0.05）；有机酸质量浓度为50 mg/L时，藻细胞OD264在培养过程中也是显著高于对照组 （配对t检验，p＜0.05），在第3天和第5天分别为初始值的3.85和8.04倍。

藻液中蛋白质和核酸是非电解质外渗物的主要成分，其变化趋势与OD264变化趋势基本一致。见图5和图6。

图5 不同质量浓度黄菖蒲有机酸对铜绿微囊藻OD280释放的影响

图6 不同质量浓度黄菖蒲有机酸对铜绿微囊藻OD260释放的影响

由图5和图6可知，有机酸质量浓度为2 mg/L时，藻液可溶性蛋白和核酸含量在培养过程中与对照组没有显著性差异（配对t检验，p＞0.05）；而有机酸质量浓度为20 mg/L时，培养第3天，藻液可溶性蛋白和核酸含量轻微增加，分别为初始值的1.35和1.26倍，第5天有较大程度的上升，分别为初始值的1.89和172倍，显著高于对照组（配对t检验，p＜0.05）；有机酸质量浓度为50 mg/L时，藻液可溶性蛋白和核酸含量在培养过程中显著高于对照组（配对t检验，p＜0.05）,在第5天分别为初始值的5.15和4.69倍,说明随着黄菖蒲有机酸组分含量的增加，铜绿微囊藻细胞受到化感作用增强，细胞膜通透性增大，胞内的蛋白质和核酸等有机物向胞外渗出，OD264增加。如加拿大一枝黄花(Solidagocanadensis L)提取物处理后，铜绿微囊藻的非电解质外渗率也显著增加[3]。实验中，藻细胞内蛋白质和核酸都在第5天爆发式释放，而藻液电导率变化相对平缓，这主要是因为，细胞膜通透性增大的时候，细胞内的K+，PO43+等离子倾向优先释放[26]，而经过持续的化感胁迫，藻细胞膜受到严重损伤，通透性进一步增大，从而促使胞内的蛋白质和核酸开始大量向胞外释放。

3 结论

不同质量浓度的黄菖蒲有机酸组分对铜绿微囊藻细胞膜通透性具有明显不同的影响。具体结果为：有机酸质量浓度为2 mg/L时对铜绿微囊藻细胞膜通透性没有显著影响，表现为，铜绿微囊藻胞内O2-·产生和K+、蛋白质及核酸释放，藻液EC及OD264未发生明显变化；而有机酸组分质量浓度为20和50 mg/L时，铜绿微囊藻细胞发生了严重的氧化损伤，胞内O2-·大量累积，膜的选择透性发生显著改变，表现为，K+大量释放，藻液电导率增加，随着化感时间的延长，细胞膜损伤严重，膜透性进一步增加，胞内蛋白质和核酸等有机物开始大量渗出。有机酸组分质量浓度越高，作用效果越明显。