橙皮素对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡的抑制效应研究

薛晋红 刘艳 王丽月 曹静 王文香 何金玲 贺忠梅

基础研究

橙皮素对H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡的抑制效应研究

薛晋红 刘艳 王丽月 曹静 王文香 何金玲 贺忠梅

目的 探讨橙皮素（HES）对H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响。方法 采用H2O2建立H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型。实验分为4组：正常对照组（Control组）、H2O2损伤组（H2O2组）、单纯橙皮素处理组（HES组）、橙皮素预处理+H2O2组（HES+H2O2组）。H2O2（400 μM）处理2 h建立心肌细胞氧化应激损伤模型，HES+H2O2组于建模前1 h加入40 μM橙皮素。采用CCK-8法确定H9c2细胞活性，DCFH-DA探针检测细胞活性氧簇（ROS）水平，流式细胞术检测心肌细胞凋亡，分光光度计检测Caspase-3活性。结果橙皮素预处理可明显改善H2O2诱导的H9c2心肌细胞活性降低，且浓度为40 μM时保护作用最明显；给予40 μM橙皮素预处理后ROS的产生明显减少，Caspase-3活性显著下降，心肌细胞凋亡率为（28.32±2.12）%，明显低于H2O2组（50.33±2.56）%（P＜0.05）。结论 橙皮素对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡具有抑制效应。

橙皮素； 氧化应激； 再灌注损伤； H9c2； 细胞凋亡

近年来，由于溶栓、气囊形成术及动脉搭桥术等再灌注疗法的快速发展和广泛应用，缺血性心脏病患者的死亡率明显降低，但再灌注所引发的慢性心衰却严重影响了患者的生存质量。大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）产生于再灌注期，通过氧化应激作用于线粒体通透性转换孔，促使线粒体释放procaspase-3等入胞浆，引起Caspase-3活化，最终导致心肌细胞凋亡[1]。过氧化氢（H2O2）是一种重要的ROS来源，能够直接氧化细胞膜上的脂质、蛋白质，穿过细胞膜与细胞内的铁离子反应生成活性更强的自由基，通过多种途径诱导细胞凋亡和坏死，故由H2O2诱导的氧化应激是心肌细胞凋亡的一种重要原因[2]。目前临床上主要用抗氧化剂来治疗氧化应激，但是机体内抗氧化酶类不能外源补充，常规抗氧化剂稳定性不足，且不能大量补充，新型的抗氧化剂又无法大规模应用于临床[3]，亟需寻求针对氧化应激治疗的新突破，因此我们开始立足于传统中医进行研究。

橙皮素（hesperetin，HES）是一种广泛存在于花卉、水果、食品等植物源性物质中的天然黄酮类化合物[4]。已有研究证实，橙皮素具有抗氧化、抗炎、抗衰老、降血脂和抗肿瘤等多种生物学活性[5-7]。然而，目前关于橙皮素对心肌细胞的保护作用研究还比较少，因此本研究采用H2O2处理H9c2心肌细胞的方法构建氧化应激损伤模型，在此基础上观察橙皮素预处理对H9c2心肌细胞活性氧的产生及细胞凋亡的影响，以阐明橙皮素对心肌再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞来源与试剂 H9c2大鼠心肌细胞购自于上海生命科学院；胎牛血清、青霉素/链霉素购自Gibco公司；高糖DMEM培养基购自HyClone公司；0.25%胰蛋白酶购自Solarbio公司；橙皮素购自Sigma公司；H2O2、活性氧试剂盒、JC-1试剂盒、Hoechst33258、CCK-8检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Caspase-3活性分光光度法检测试剂盒购自南京碧波生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 实验分为4组：对照组，Control组；H2O2组，H2O2400 μM 处理细胞 2 h；HES 组，HES 40 μM 处理细胞 3 h；HES+H2O2组，HES 40 μM预处理细胞1 h后加入H2O2400 μM 处理细胞2 h。

1.2.2 细胞培养与氧化应激模型建立 含有10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养H9c2心肌细胞，细胞密度达80%～90%后用于实验。用无血清DMEM培养基稀释H2O2后制备成 25、50、100、200、400、800 μM 浓度梯度的处理液，分别处理H9c2 2 h，根据CCK-8实验结果选择最佳H2O2干预浓度。

1.2.3 CCK-8检测细胞活性 密度为5×103个/ml的细胞接种于96孔培养板，放入培养箱培养24 h。①加入不同浓度的 H2O2（25、50、100、200、400、800 μM）每组设5个平行孔，继续培养2 h。②加入不同浓度的橙皮素（10、20，40、80、160 μM），继续培养 24 h③加入 10、20、40 μM 的橙皮素预处理 1 h 后，加入H2O2400 μM处理2 h。④干预结束后，按1∶10比例每孔中加入CCK-8检测液，培养箱孵育1 h后，450 nm处测定吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.4 ROS的检测 接种密度为2×105个/ml的细胞于6孔培养板中，在5%CO2、37℃培养箱中培养24 h。加入橙皮素40 μM预处理1 h后，H2O2400 μM损伤2 h。干预结束后用无血清的DMEM培养液稀释DFCH-DA至10 μM，每孔加入1 ml稀释后的DFCH-DA溶液，培养箱继续培养30 min无血清DMEM培养液洗3次，用荧光显微镜拍照。

1.2.5 细胞凋亡水平的测定

1.2.5.1 流式细胞术检测细胞凋亡 接种密度为2×105个/ml的细胞于6孔培养板中，干预结束后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞后，离心重悬并过滤细胞，细胞中加入Annexin V-FITC和PI工作液，室温避光孵育15 min。加入250 μl 1×Annexin V-FITC结合缓冲液，测细胞凋亡率。

1.2.5.2 Caspase-3活性的检测 按照文献报道的方法[8]，于干预结束后检测Caspase-3活性，酶标仪λ=405 nm测定吸光度值。

1.3 统计学方法 用GraphPad Prism 6.0软件作图。实验数据以±s表示，采用t检验及单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度H2O2对H9c2心肌细胞存活率的影响 CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，不同浓度的H2O2（25、50、100、200、400、800 μM）处理2 h均可降低H9c2心肌细胞的存活率，且具有浓度依懒性（P＜0.05）。H2O2浓度为 400 μM 时，心肌细胞存活率为52.92%，接近50.00%，提示400 μM浓度的H2O2能够兼顾诱导氧化应激损伤和适当的细胞活力，故在后续实验中选择400 μM H2O2作为氧化应激的干预模型。见图1。

2.2 不同浓度橙皮素对H9c2心肌细胞活性的影响 细胞活性检测结果显示，给予不同浓度的橙皮素（10、20、40、80、160 μM）处理 H9c2 心肌细胞 24 h与对照组相比，橙皮素在浓度为10～80 μM时对细胞存活率无明显影响，其存活率分别为（98.53±0.54）%、（97.88±0.82）%、（97.63±0.40）%和（90.24±1.13）%；当橙皮素浓度为160 μM时，细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 橙皮素预处理可降低H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤 给予不同浓度橙皮素（10、20、40 μM）预处理H9c2细胞1 h后，加入H2O2400 μM处理2 h，结果显示，与单纯H2O2组相比，不同浓度的橙皮素均可改善细胞的存活率（P＜0.05），并在40 μM时达到峰值，因此在后续实验中选择40 μM橙皮素作为干预浓度，见图3。

2.4 橙皮素预处理可减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞ROS生成 用DCFH-DA探针检测ROS水平，荧光显微镜下ROS呈现绿色荧光，结果显示，与对照组相比，H2O2组H9c2心肌细胞中ROS释放明显增多（P＜0.05）；HES+H2O2组 ROS释放较H2O2组明显减少（P＜0.05）；而 HES组与对照组的ROS释放无明显差异。见图4。

2.5 橙皮素预处理减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞细胞凋亡 为了进一步明确橙皮素是否可减轻氧化应激诱导的心肌细胞凋亡，采用流式细胞术进行检测。结果显示，与对照组相比，H2O2组细胞早凋和晚凋明显增多，总凋亡率达到50%左右；与H2O2组比，HES+H2O2组的细胞凋亡明显减少，总凋亡率为30%左右。Caspase-3活性检测结果显示，与对照组相比，H2O2组Caspase-3活性明显增加；与H2O2组比，HES+H2O2组Caspase-3活性显著下降，且差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比，HES组细胞凋亡无明显变化。见图5。

3 讨论

氧化应激是心肌缺血再灌注损伤主要的病理生理机制[9]。研究表明，给予抗氧化药物或者提高内源性抗氧化酶的活性，能有效减轻心肌的缺血再灌注损伤[10,11]。橙皮素是普遍存在于柑橘类水果中的黄酮素，具有较强的抗氧化效应。本实验旨在探讨橙皮素对氧化应激损伤条件下的心肌细胞是否具有保护作用。

本研究发现，H2O2400 μM处理H9c2心肌2 h，细胞存活率为50%左右，表明采用H2O2建立氧化应激损伤模型成功，这一结果与Hsu等[12]和Chen等[13]的结果相一致。橙皮素属于二氢黄酮的一种。已有研究发现，橙皮素以浓度依赖的方式减轻LPS诱导的大鼠心肌细胞凋亡[14]。本实验结果显示，10～40 μM浓度的橙皮素对H9c2细胞活性无明显影响，而对H2O2诱导的H9c2心肌细胞活性的降低有显著的改善作用，并且呈浓度依赖性，说明橙皮素提高心肌细胞的活性是其药理作用的结果。

本实验选用40 μM的橙皮素作为最佳浓度研究其对心肌细胞氧化应激的保护作用。有研究表明，橙皮素通过PPAR-γ信号通路降低氧化应激，减轻细胞凋亡，改善了异丙基肾上腺素诱导的大鼠心脏功能障碍[15]。H2O2作为一种常用的氧化应激化学诱导剂，能够引起明显的细胞氧化损伤，而ROS生成过多是氧化应激发生的标志，因此抑制ROS的产生是抗氧化的关键步骤。本研究发现，橙皮素预处理可显著减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞ROS产生，抑制Caspase-3活性升高，进而减轻细胞凋亡。

近年来研究发现，心肌细胞凋亡是缺血性心脏病、缺血再灌注损伤、心力衰竭等疾病中细胞丢失的主要原因[16]。本实验中，橙皮素具有抑制ROS产生、降低氧化应激水平、降低Caspase-3活性及减轻心肌细胞凋亡的效应，说明橙皮素可能具有心肌保护作用。本研究可为将橙皮素作为治疗心肌氧化应激损伤的新方案提供基础实验数据。

图1 H2O2对各组H9c2心肌细胞存活率的影响

图2 橙皮素对H9c2细胞的活性影响

图3 各组细胞存活率比较

图4 各组ROS产生量比较

图5 橙皮素对H2O2处理的H9c2细胞凋亡的作用

［1］Gustafsson AB，Gottlieb RA.Mechanisms of apoptosis in the heart.J Clin Immunol，2003，23：447-459.

［2］Sharikabad MN，Ostbye KM，Brors O.Effect of hydrogen peroxide on reoxygenation-induced Ca2+accumu-lation in rat cardiomyocytes.Free Radic Biol Med，2004，37：531-538.

［3］Cifuentes ME，Pagano PJ.Targeting reactive oxygen species in hypertension.Curr Opin Nephrol Hypertens，2006，5：179-186.

［4］Yang HL，Chen SC，Senthil KKJ，et al.Antioxidant and anti inflammatory potential of hesperetin metabolites obtained from hesperetin－administered rat serum：an ex vivo approach.J Agric Food Chem，2012，60：522－532.

［5］Ye L，Chan FL，Chen S，et al.The citrus flavonone hesperetin inhibits growth of aromatase-expressing MCF-7 tumor in ovariectomized athymic mice.Nutr Biochem，2012，23：1230－1237.

［6］Yoshida H，Takamura N，Shuto T，et al.The citrus flavonoids hesperetin and naringenin block the lipolytic actions of TNF-alphain mouseadipocytes.Biochem BiophysResCommun，2010，394：728－732.

［7］Trivedi PP，Kushwaha S，Tripathi DN，et al.Cardioprotective effects of hesperetin against doxorubicin－induced oxidative stress and DNA damage in rat.Cardiovasc Toxicol，2011，11：215－225.

［8］刘晓波，杨啸，姚艳玲.腺病毒过表达TXNIP对INS-1胰岛细胞损伤和凋亡的影响.中国心血管病研究，2014，12：1127-1132

［9］Zhao ZQ.Oxidative stress-elicited myocardial apoptosis during reperfusion.Curr Opin Pharmacol，2004，4：159-156.

［10］ Ghyasi R，Sepeheri G，Mohammadi M，et al.Effect of mebudipine on oxidative stress and lipid peroxidation in myocardial ischemic-reperfusion injury in male rat.J Res Med Sci，2012，17：1150-1155.

［11］Wang Y，Zhang ZZ，Wu Y，et al.Honokiol protects rat hearts againstmyocardialischemiareperfusion injurybyreducing oxidative stress and inflammation.Exp Ther Med，2013，5：315-319.

［12］Hsu HC，Chen CY，Chiang CH，et al.Eicosapentaenoic acid attenuated oxidative stress-induced cardiomyoblast apoptosis by activating adaptive autophagy.Eur J Nutr，2014，53：541-547.

［13］Chen WC，Hsieh SR，Chiu CH，et al.Molecular identification for epigallocatechin -3 - gallate-mediated antioxidant intervention on the H2O2-induced oxidative stress in H9c2 rat cardiomyobiasts.J Biomed Sci，2014，21：56.

［14］ Yang Z， Liu Y， Deng W，et al.Hesperetin attenuates mitochondria-dependentapoptosis in lipopolysaccharide -induced H9C2 cardiomyocytes.Mol Med Rep，2014，9：1941-1946.

［15］Agrawal YO，Sharma PK，Shrivastava B，et al.Hesperidin blunts streptozotocin-isoproternol induced myocardial toxicity in rats by altering of PPAR-gamma receptor.Chem Biol Interact，2014，219：211-220.

［16］刘永利，张基昌，潘洪涛.左西孟旦对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用.中国心血管病研究，2015，13：1033-1037.

Effect of hesperetin in inhibition on H9c2 cardiomyocytes apoptosis induced by H2O2

XUE Jin-hong，LIU Yan，WANG Li-yue，et al.Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences,Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

HE Zhong-mei，E-mail：hezmei@126.com

Objective To study the protective effects of hesperetin pretreatment on H9c2 cardiomyocytes after oxidative stress injured by hydrogen peroxide （H2O2）.MethodsH9c2 cells were treated with H2O2to establish a myocardial injury model.The experiment was divided into four groups：control group；model group（H2O2）；hesperetin pretreated group （HES）and hesperetin pretreated+model group （HES+H2O2）.H9c2 cardiomyocytes in model group and hesperetin pretreated+model group were exposed H2O2to for 2 h for establishing the model of oxidative stress injury.Hesperetin pretreated+model group were pretreated with hesperetin for 1 h befor subjected H2O2to exposure.After the indicated treatment，the cell viability was assessd with CCK-8 kit：ROS levels were detected by DCFH-DA probe;cell apoptosis were analyzed by d flow cytometry and Caspase-3 activities were also detected.ResultsThe improvement of hesperetin pretreatment on H9c2 cells activity decrease which induced by H2O2，and this phenomenon was observed obviously on the concentration of 40 μM.On the concentration of 40 μM，hesperetin pretreatment could reduce ROS production，increase Caspase-3 activity and the apoptosis of myocardial cells（28.32±2.12）%was significantly decreased in the H2O2group（50.33±2.56）%（P＜0.05）.ConclusionHesperetin pretreatment can provide significantly cardioprotective effects against oxidative stress injury.

Hesperetin； Oxidative stress； Ischemia-reperfusion injury； H9c2； Apoptosis

山西省自然科学基金（项目编号：2016011115，2012011040-7）；

030001 山西省太原市，山西医科大学基础医学院生理学系，细胞生理学山西省重点实验室

贺忠梅，E-mail：hezmei@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．03．022

R542.2

A

1672-5301（2017）03-0276-04

2016-09-29）

山西医科大学科技创新基金（项目编号：01201501）