HBx基因诱导肝卵圆细胞恶性转化并促进其发生侵袭转移*

刘顺芳, 董可帅 , 张尊义 , 董汉华△

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1肿瘤科 2肝脏外科,武汉 430030

HBx基因诱导肝卵圆细胞恶性转化并促进其发生侵袭转移*

刘顺芳1, 董可帅2, 张尊义2, 董汉华2△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1肿瘤科2肝脏外科,武汉 430030

目的 研究HBx对肝卵圆细胞发生恶性转化并上皮-间质转化(EMT)的影响。方法 以稳定表达HBx的转基因卵圆细胞株pEGFP-HBx-LE/6为实验组，pEGFP-LE/6卵圆细胞为对照组。使用Western blotting、Transwell细胞侵袭实验、划痕实验、CCK-8等检测pEGFP-HBx-LE/6在细胞周期、分化标志物以及增殖转移能力方面的变化。结果 ①实验组细胞体积增大、具有明显异形性，CK-19、CK-7表达明显下降，AFP、HNF-4α表达升高；②实验组细胞的增殖能力明显升高，克隆形成能力、侵袭能力、划痕恢复能力明显增强；③与对照组比较，实验组E-cadherin表达水平明显下降，而N-cadherin、α-SMA、Vimentin表达水平明显上升。结论 HBx基因可诱导肝卵圆细胞向恶性转化，并促进其转移。

卵圆细胞； HBx； 上皮-间质转化

肝卵圆细胞被认为是肝脏前体干细胞，体内外实验证实其可以根据局部微环境的不同分化为多种细胞，并且参与了肝癌的发生发展过程[1]。目前肝细胞癌的治疗难点主要在于肝切除术后容易复发、容易伴发肝内播散及血管侵犯。我们的前期研究发现动物以及人肝切除术后标本均可发现卵圆细胞增殖明显增强，肝内种植转染了乙型肝炎病毒X基因(HBx)的卵圆细胞可以导致原位发生肝细胞癌[2]，肝内微环境的改变可以显著改变肝卵圆细胞的分化状态，导致肝癌的发生。但是目前对于肝脏前体干细胞与肝细胞癌伴发肝内播散以及血管侵犯的关系并不清楚。为此我们将携带HBx的质粒转入大鼠卵圆细胞(LE/6)并进一步观察其侵袭转移能力的变化，为肝卵圆细胞作为肝癌起源提供进一步的证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(CK-7、CK-19)、HBx、甲胎蛋白(AFP)、肝细胞核因子4α(HNF-4α)、上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等的抗体均购自Santa Cruz公司(美国)，胎牛血清购自Gibco公司(美国)，OPTI-MEM和Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司(美国)。

1.2 细胞培养

大鼠肝卵圆细胞LE/6细胞株由美国华盛顿大学病理科Nelson Fausto教授馈赠，使用含有10%胎牛血清、1 μg/mL胰岛素(Sigma公司)、0.5 μg/mL氢化可的松(Sigma公司)的Ham’s F-10培养液(Gibco公司)在37℃、5%CO2条件下常规培养传代。

1.3 细胞转染

选择对数生长期的LE/6细胞，当6孔培养板细胞汇合度达到80%时，经10 μL的Lipofectamine2000(用OPTI-MEM稀释)介导pEGFP-HBx或者pEGFP转染LE/6。6 h后将培养液更换为含10%胎牛血清的F-10培养液。

1.4 Western blot检测

使用RIPA蛋白裂解液在冰上裂解肝癌、癌周组织以及培养细胞，按常规方法提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，将40 μg蛋白加至10%SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳，按常规方法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)上，用含5%脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液(TBST)37℃封闭1 h，然后加入相应一抗，4℃摇床中过夜，TBST洗涤10 min×3次，加入相应的稀释二抗在37℃孵育1 h，ECL化学发光试剂孵育PVDF膜后，放入图像采集仪器中，采集图像。

1.5 细胞增殖能力检测

CCK-8检测：取对数生长期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6细胞，于10%胰酶消化1 min后，分别计数，按每孔1 000细胞平铺于96孔板，每组各设3个复孔，于细胞培养箱培养12 h，分别于贴壁后24、48、72、96 h按培养液∶CCK-8原液=10∶1加入培养液中，常温孵育1 h后，检测其460 nm处吸光度值。克隆形成实验：取对数生长期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6细胞，于10%胰酶消化1 min后，分别计数，按每孔100细胞平铺于6孔板，每组各设3个复孔，于细胞培养箱培养2周，吸弃培养液。加入甲醛溶液固定10 min，吸弃上清后加入结晶紫染液染色5～10 min，图像检测。

1.6 细胞侵袭能力检测

划痕实验取对数生长期的pEGFP-LE/6以及pEGFP-HBx-LE/6细胞，于10%胰酶消化1 min后，分别计数，按每孔1×105细胞将其平铺于6孔板，于恒温细胞培养箱培养观察，待其汇合度达到100%后，将培养液换为不含血清的F-10培养液，取10 μL移液器枪头在培养皿轻轻划出一痕迹，于0、4、8、12 h于倒置显微镜下拍照观察划痕恢复情况，计算测量时划痕宽度与初始划痕宽度的比值。Transwell细胞侵袭实验：将Matrigel胶质置于冰上静置1 h，待其液化，迅速吸取10 μL与40 μL无血清DMEM培养液混合均匀，加入到Transwell小室。置于37℃静置40 min，待其风干。将Transwell小室放入24孔细胞培养板，在上室加入300 μL DMEM培养液，用PBS洗涤2遍，用无血清DMEM调整细胞密度至107/mL，加入100 μL于Transwell小室内。于下室中加入500 μL含10%FBS的DMEM。于37℃ 5%CO2培养箱中培养8 h，染色计数。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，结果中的计量指标以±s表示，组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染HBx基因后可直接诱导肝卵圆细胞向恶性转化

实验组pEGFP-HBx-LE/6细胞体积比对照pEGFP-LE/6明显增大、具有明显异形性。Western blot检测发现实验组中卵圆细胞标志物CK-19、CK-7表达明显下降，而肝脏肿瘤标志物AFP和肝细胞标志物HNF-4α的表达量明显升高(图1)，说明转入HBx后，卵圆细胞有分化并向恶性转化的趋势。

①：LE/6；②：pEGFP-LE/6；③：pEGFP-HBx-LE/6；稳定转染HBx后，卵圆细胞标志物(CK-19、CK-7)表达量下降，肝脏肿瘤标志物AFP和肝细胞标志物HNF-4α表达量升高*P<0.05
图1 Western blotting法检测细胞因子表达变化
Fig.1 Western blotting to detect the changes of cytokine expression

2.2 pEGFP-HBx-LE/6细胞增殖能力、侵袭能力的变化

CCK-8法检测显示实验组pEGFP-HBx-LE/6细胞增殖能力明显提高，增殖速度明显提高(P<0.05)(图2A)，同时克隆形成实验提示实验组稳定转染HBx后，细胞克隆形成能力明显增强，增殖速度明显加快(图2B、E)。划痕实验提示划痕12 h以后，pEGFP-HBx-LE/6细胞划痕恢复速度明显加快(图2C、F)，在Transwell侵袭实验中，实验组细胞转移能力明显增强(图2D、G)。

稳定转染HBx分子后，卵圆细胞的增殖能力明显升高(A)，克隆形成能力(B、E)、划痕恢复能力(C、F)、侵袭能力(D、G)明显增强；*P<0.05图2 稳定表达HBx卵圆细胞增殖能力及侵袭能力的变化Fig.2 The change of proliferation ability and invasion ability in oval cells after stably expressing HBx

2.3 HBx与上皮-间质转化(EMT)相关指标变化

进一步研究发现，实验组pEGFP-HBx-LE/6细胞系中EMT相关指标(E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin)发生了明显变化。LE/6细胞转入HBx基因后，E-cadherin表达水平明显下降，而间叶组织因子(N-cadherin、α-SMA、Vimentin)表达水平明显上升(图3)。提示EMT可能参与HBx诱导卵圆细胞系发生转移。

①:pEGFP-LE/6;②:pEGFP-HBx-LE/6;稳定转染HBx分子后E-cadherin表达水平明显下降，而N-cadherin，α-SMA，Vimentin表达水平明显上升。图3 Western blot法检测EMT通路相关蛋白表达Fig.3 Western blotting to check the expression level of EMT associated molecules

3 讨论

目前在各种肿瘤中均发现了肿瘤干细胞[3]。肝卵圆细胞被认为是成年动物肝脏内的成体干细胞，正常情况下处于休眠状态，一般位于小叶间胆管和Hering’s管，具有自我增殖、自我更新和多向分化的能力，而这些特性与肿瘤干细胞极其相似。我们前期研究发现，肝硬化和肝癌组织中均有不同程度的卵圆细胞增殖，而在正常肝组织中未见其增殖。同时发现HBx基因在卵圆细胞中的整合率与其在肝硬化和肝癌组织中的整合率相似(85%)。这些结果都提示卵圆细胞可能通过转染HBx基因而发生癌变。

已有较多实验表明肝卵圆细胞在特定肝脏微环境中可以转化为多种细胞[4-5]，而且已有相关研究表明在肝癌组织中发现了肝卵圆细胞，表明肝癌可能起源于卵圆细胞的异常分化[1，6-8]。我国肝癌患者中80%合并有乙肝病毒，病程通常为肝炎、肝纤维化、肝硬化、最终形成肝癌。临床上我们发现，肝脏肿瘤通常合并有早期肝内转移或者门脉癌栓等情况，对于此类患者即使行手术切除，术后5年生存率亦很低[9-10]。因此我们推测肝癌发生以及侵袭转移的发生可能在疾病的初始过程就已经发生。乙肝感染作为肝癌发生发展的重要因素[11]，已经有越来越多的研究表明HBx作为乙肝感染的重要分子在肝癌发生发展中起着重要的作用[12]。HBx可以激活多种细胞转录因子，如AP-1、NF-κB以及CREB等从而调控靶基因的表达[13]。前期实验中我们已经证实，HBx可能促进肝卵圆细胞向恶性转化[2，14]，我们推测HBx在肝脏肿瘤发生过程中可能起到促进转移的作用。

本次研究结果表明，在转染HBx基因后，肝脏卵圆细胞标志物表达下降，而肝脏细胞标志(白蛋白、HNF-4α)明显升高，同时肝脏肿瘤标志AFP出现高表达。这表明在转染HBx基因之后，肝卵圆细胞失去了干细胞特性，并有向肝恶性肿瘤转化的趋势。通过进一步实验研究证实，转染HBx基因后，实验组卵圆细胞的增殖和转移能力明显增强，同时EMT相关信号通路发生了显著性改变，E-cadherin表达量明显下降，而N-cadherin、α-SMA、Vimentin表达水平明显上调，提示HBx基因可以通过EMT信号通路影响肝脏肿瘤的侵袭转移能力。

通过我们的研究发现，肝卵圆细胞在HBx的诱导作用下可转化为肝癌细胞，同时通过发生EMT过程增强其增殖及转移能力。证实肝癌的发生可能是卵圆细胞转染HBx后发生恶性转化形成，同时肝癌细胞的增殖以及早期转移可能是同时发生的，而且与乙型肝炎病毒感染有着密切关系，但是其具体机制还有待进一步深入研究。

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(2017-04-27 收稿)

HBx Gene Induces Malignant Transformation of Hepatic Oval Cells and Promotes Their Invasion and Metastasis

Liu Shunfang1，Dong Keshuai2，Zhang Zunyi2etal

1Department of Oncology，2Hepatic Surgery Center，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the effect of HBx gene on the tumorigenesis and metastatic ability of hepatic oval cells.Methods HBx gene or vector gene was transfected into hepatic oval cell line LE/6，serving as experimental group and control group，respectively.Western blotting，Transwell assay，and CCK-8 assay were applied to explore the effect of HBx gene on the tumorigenesis and metastatic ability of oval cells.Results ①The volume of cells in the experiment group was increased and the atypia was obvious.The expression of CK-19 and CK-7 was significantly decreased，and that of AFP and HNF-4α increased；②The proliferation of pEGFP-HBx-LE/6 cells was significantly increased.The colony forming ability，invasion ability and scratch recovery ability were enhanced obviously；③As compared with the control group，the expression level of E-cadherin was significantly decreased，and that of N-cadherin，α-SMA and Vimentin increased significantly in the experimental group.Conclusion HBx gene is confirmed to promote the metastatic ability and tumorigenesis of hepatic oval cells.

oval cells； HBx； epithelial mesenchymal transition

*国家自然科学基金青年基金资助项目(No.81402410，No.81602626)

R322.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.008

刘顺芳，男，1982年生，主治医师，E-mail：liushunfang28@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：hanhua_dong@hotmail.com