成体肾脏干/祖细胞特异性标记分子研究中的争议

吴燕升 综述 高建东 审校

·基础医学·

成体肾脏干/祖细胞特异性标记分子研究中的争议

吴燕升 综述 高建东 审校

目前已有大量研究证实肾脏中干/祖细胞的存在，成为损伤后细胞修复新的研究方向。虽然诸多研究证实了成体肾脏干/祖细胞通过增殖和(或)旁分泌作用保护肾脏损伤，但是对于成体肾脏中是否真实存在促进肾脏发育和再生的干/祖细胞，学术界仍存在大量争议。成体肾脏包囊和肾小管中CD133和CD24双阳性细胞被认为是成体肾脏干/祖细胞的特异性标记分子，为肾脏细胞损伤后再生提供了可能性。自体肾脏干细胞的体外培养可能会成为慢性肾脏病尤其是终末期肾病一种有前景的治疗手段。

成体肾干/祖细胞 分化型小管细胞 包囊 足细胞 肾脏再生

慢性肾脏病(CKD)已成为21世纪人类面临的全球性公共健康问题。不管何种病因导致的CKD,其最终都可能进展为终末期肾病(ESRD)，需要依赖透析或肾移植,消耗巨大资金及卫生资源。但透析仅代替了肾脏滤过功能，并不能完成肾脏内环境稳定、代谢和内分泌等其它重要功能；而肾移植则面临着供体短缺、移植后免疫排斥、手术并发症等诸多问题。寻求新的治疗手段,延缓CKD的进展、预防及治疗ESRD，已成为当今国际医学界临床和科研工作亟待解决的重要课题。

肾脏再生是指肾损伤后修复以及局部或整体肾单位的再生。因为肾脏结构复杂，肾组织中缺乏新的肾单位发生的区域，人类肾脏再生的难度高于任何其他器官。然而在许多研究中已经鉴定出用药物调控肾脏细胞的方法或是从遗传学角度促进肾脏再生的方法，肾脏干/祖细胞成为肾脏再生医学中最有前景的研究内容。本文主要简介成体肾脏干/祖细胞及其特异性标记分子的研究进展和存在的争议问题，希望能对肾损伤修复的研究提出新的思考方向。

成体肾脏中干/祖细胞的定位

干细胞是一类具有自我更新、多系分化和高度增殖的细胞。成体肾组织中存在干细胞，是参与肾修复的细胞群，在肾脏修复中起重要作用。与干细胞类似，祖细胞表现出沿着一种或多种特定细胞系分化的潜能。肾脏干/祖细胞代表着肾脏再生和发育的基本单位[1]。通常，哺乳动物在出生时即失去产生新的肾单位的能力，但是成体肾脏仍保留了通过祖细胞在损伤肾单位进行细胞再生的能力。Osafune[2]认为，成体肾脏祖细胞来源于多能干细胞的分化或重新编程。残肾干/祖细胞不仅直接参与肾脏损伤后修复的过程，而且具有促进肾脏再生的能力。它们既可直接地分化为肾脏细胞并与残肾组织融为一体，也可通过旁分泌因子诱导和促进损伤肾脏的再生[3]。

近些年较为公认的是，成体肾脏干/祖细胞分散在肾小管尤其是肾单位近端小管S3段的上皮细胞和包曼氏囊中。2013年，Buzhor等[4]用免疫分选技术，以NCAM1为表面标记靶点，鉴定并描绘了人肾脏类似干/祖细胞特征的细胞群，主要来源于人肾脏上皮细胞。NCAM1+细胞表达于大鼠近端小管S3段，控制间充质细胞表型，强烈表达SIX2等干/祖细胞标记蛋白，支持早期的祖细胞特性。2014年，Rinkevich等[5]也提出了鼠科动物肾脏内定向分化的祖细胞的存在，并且驱动肾脏的发育、维持和再生。同年，日本研究者Kitamura等[6]用来源于成体大鼠肾单位S3段肾脏干/祖细胞在体外构建出三维立体肾脏样结构。当肾脏干细胞团悬浮于细胞外基质，在多种细胞因子的参与下，可形成完整的肾脏组织结构，包括肾小球、近曲小管、髓袢、远曲小管和集合管，但是没有脉管系统。在没有肾脏发育所必需的后肾基质和输尿管芽存在的条件下，肾脏干/祖细胞分化出了肾脏结构，进一步证明了成体肾脏干/祖细胞分散在肾小管，尤其来源于肾单位近端小管S3段的上皮细胞。2015年，Faa等[7]聚焦于新生儿肾脏，认为肾脏干/祖细胞存在于包囊、部分肾小管上皮细胞中，它们正是多种细胞发育的“水库”，在成年期也很可能依然存在，这些干/祖细胞即是成体肾单位使死亡细胞“起死回生”的原因所在，这也很可能是成体肾脏同胚胎肾脏一样逆转肾单位再生的唯一机制。

近年来也有研究表明，成体肾脏干/祖细胞可能定位于分化型肾小管细胞中[8]，其修复损伤的机制在于在“去分化”和“再分化”的过程。肾脏损伤后，分化型的肾小管细胞可增殖、迁移至周围死亡细胞并取而代之。肾小管细胞在修复损伤的过程中，再生的肾小管细胞发生的表型改变称之为“去分化”过程。在健康成年人肾脏中，肾小管细胞是柱状立方体，表达角蛋白和连接蛋白，构成上皮细胞顶。而损伤后再生的肾小管细胞失去了上皮细胞顶，表现出扁平的长方体形态特征，表达中间丝状体波形蛋白，获得了后肾间质来源的胚肾干/祖细胞表型。表明肾脏再生首先是肾小管上皮细胞“去分化”，伴随而来的是小管细胞“再分化”，这时候上皮细胞失去间叶细胞标记物，上皮细胞表型恢复，生理功能恢复[9]。

成体肾脏干/祖细胞存在的争议

肾脏在稳定状态下，细胞更新速率过慢，再生能力受限。迄今为止，对肾脏干细胞的研究大多集中在对发育中的胚肾或者是急性肾损伤中的残肾，仍无确切证据证明成体肾脏中干细胞存在。Hartman 等[10]认为，在肾脏完全发育后，帽状间质/后肾间质中已不存在自我更新的祖细胞。他们发现，小鼠在出生3天后，不仅帽状间质的标记基因SIX2没有表达，甚至在缺血性损伤后，也没有SIX2基因的任何活化现象,表明成体肾脏不可能再现帽状间质的肾脏再生通路。Humphreys等[11]也认为，近端小管的损伤修复过程与特异性祖细胞无关。他们通过研究表明，损伤后新的上皮细胞产生是通过健存细胞的自我复制。在缺血再灌注损伤后所谓的“祖细胞”随时间延长而减少，它们并没有增殖也没有迁移到外部的髓质或皮质。因此，祖细胞并没有参与损伤后上皮细胞的修复。

此外，成体肾脏残存的肾单位中分化型小管细胞增殖并不能形成新的肾单位，Vogetseder等[12]发现大多数分化型小管细胞都具有增殖的潜能，不论是正常肾脏细胞的自我更新还是损伤后的修复，都存在着成熟小管细胞对坏死细胞的替代。另一项研究中，Kusaba等[13]通过细胞损伤和修复后的克隆分析表明小管内并无干/祖细胞群存在的证据，是终末分化的上皮细胞在损伤后诱导去分化和修复期间再表达了干细胞标记物。

而研究者们所分离出来的“祖细胞”，实际上很有可能是分化细胞。第一，成体肾脏中分化型细胞表现出类似干/祖细胞增殖克隆和自我更新的特性，这可能成为了研究者们误认为是干/祖细胞的主要原因。第二，体外培养细胞研究显示，在上皮细胞发生上皮-间充质细胞转化(EMT)期间，已分化的上皮细胞会发生非特异性表型改变，虽然这些细胞显示出了明显的增殖和迁移特性，但是它们的本质很有可能是纤维原或间充质细胞，缺乏功能上的相关性。第三，使用鉴别干细胞的细胞表面标记分子和功能参数与已分化的细胞类型重叠，或仅仅是分化型细胞的标记物。第四，缺乏对所谓的“祖细胞”实验设计的合理控制，也可能造成了误解[14]。虽然肾脏损伤后，肾脏发育的某些基因确实被上调，部分地再现了肾脏发生的过程，可能指示出成体肾脏祖细胞的存在，但是这样的细胞数量太少不能够达到肾脏再生和修复肾损伤的可测量标准。

CD133+和CD24+在成体肾干/祖细胞的特异性表达

在人类成体肾脏中，肾祖细胞发育未完全，表现出定向分化成足细胞或小管上皮细胞的潜能[15]。Lindgren等[16]在成年人肾脏组织中分离出了一群高表达乙醛脱氢酶的细胞群，这被认为是多种器官系统中干/祖细胞的共同特征。通过乙醛脱氢酶基因表达谱和肾皮质组织免疫组化技术发现，有一些数量十分稀少的细胞群分散在健康成年人肾脏近端小管的上皮层，它们共表达CD133和CD24,这两个标记物有选择地表现出包曼氏囊中干/祖细胞的特征。

CD133是主要用来鉴定器官和肿瘤组织中干/祖细胞的表面抗原，已被证明表达于小鼠和人类终末分化的上皮细胞极顶部，尤其是肾脏近端小管部分。CD133+细胞来源于正常成年人肾脏的多能祖细胞，具有增殖和自我更新的潜能。研究发现，成人肾间质中可分离出CD133+细胞群，能高度增殖并产生内皮细胞和上皮细胞表型和功能特点，是成体肾脏再生的来源[17]。Kusaba等[13]通过基因谱系分析证明CD133是小鼠近端小管损伤修复过程中上皮细胞去分化的特异性标记物。CD24是表达于人后肾间质的表面分子，它也表达于许多肿瘤组织中，如胰腺癌肿瘤干细胞，在糖基化作用下与细胞膜联接并通过磷脂酰肌糖转移到细胞内[18]。CD133+细胞在人类肾脏发育过程中是CD24+细胞的子集。在成体肾脏干/祖细胞中，CD133与CD24总是共表达的[19]。包囊中位于尿极表达CD133、CD24，但不表达PDX(足细胞标志蛋白)的祖细胞(CD133+CD24+PDX-)可再生小管细胞和足细胞，而细胞位于尿极与血管极之间，既表达祖细胞标记物CD133、CD24，又表达足细胞标记物PDX(CD133+CD24+PDX+)，只能再生足细胞[20]。而小管祖细胞以低水平表达CD133和CD24为特征，能够增殖和分化成为近端小管细胞、亨利套、远端小管细胞，从而起到肾损伤的修复作用[21]。小管祖细胞区别于包囊祖细胞的特征是在于它们不表达CD106(血管黏附分子1)，即CD133+CD24+CD106+的祖细胞可分化为足细胞和小管细胞，而CD133+CD24+CD106-的祖细胞只能分化为小管细胞。近端小管S3段祖细胞共表达CD133和CD24可作为近端小管上皮祖细胞特异性标志物[22]。CD133+和CD24+共表达作为小管祖细胞和包囊祖细胞的标记物(图1)，是具有唯一特征性的，肾单位的其他上皮细胞并不具有这一性质。生物信息学描绘了这些CD133+和CD24+细胞转录组的详细特征，它们具有抵抗急性肾小管损伤的表型，更重要的是，这些祖细胞共表达上皮细胞和间充质细胞表型的特征是独一无二的[23],在成体肾脏和胚胎肾脏中同样存在，并且是鉴别胚肾中分化型上皮细胞的主要标记物。

图1 肾脏包囊和肾小管祖细胞示意图

CD133+和CD24+细胞被认为是肾脏包囊和小管干-祖细胞的特异性标记物[24]，不少研究者在此基础上也开展了相应的研究证实，CD133+和CD24+细胞增殖有助于肾损伤的恢复。Grange等[25]发现CD133+祖细胞在急性肾损伤模型中表现出了与间充质干细胞类似的功能特点，能够促进肾功能恢复、阻止肾小管细胞硬化，刺激残余细胞增殖和存活，表明人类CD133+祖细胞能够促进肾脏再生。Ronconi等[26]证明了在成年人肾脏内存在CD133+和CD24+的祖细胞群，以精确的序列排列在包曼氏囊内、具有多向分化和再生的潜能。向阿霉素肾病小鼠注射CD133+CD24+PDX-的细胞，发现可减轻蛋白尿，改善慢性肾小球损伤。表明CD133+CD24+PDX-的肾内祖细胞可用于治疗足细胞损伤、蛋白尿和严重肾小球硬化症。

成体肾脏干/祖细胞保护肾脏的研究

研究表明，小管祖细胞仅占全部小管细胞2%～6%，但是能够抵抗细胞死亡。当分化型小管细胞死亡时，祖细胞所占比例会迅速上升。急性肾损伤病人细胞再生过程中显示出明显的CD133+CD24+CD106-祖细胞的增殖[20]。Cakiroglu等[27]在大鼠急性肾损伤模型中发现，促红细胞生成素(EPO)治疗后导致肾血管内皮细胞中CD133+CD24+双阳性细胞显著增多， 说明EPO能够加强肾脏内皮祖细胞和外周血干细胞的招募起到对急性肾损伤的治疗作用。Benigni等[28]向重症综合性免疫缺陷小鼠静脉注射同源CD133+和CD24+细胞，可有助于小管结构的重塑和明显缓解横纹肌溶解导致的急性肾损伤。Huang等[29]通过实验研究发现，淫羊藿苷能够有效地保护5/6肾切除大鼠的肾损伤，上调HGF,BMP-7,WT-1,Pax2等胚胎标记物的表达及增加CD24+/ CD133+肾干/祖细胞的数量。因此，淫羊藿苷可能通过促进肾脏干/祖细胞的增殖发挥了保护肾脏的作用。

Romagnani和Kalluri[30]认为，大多数受损或坏死的肾小管上皮细胞得以修复是通过成体肾脏中干/祖细胞的作用，故他们提出很可能需要操纵损伤修复过程，减慢纤维应答，使肾干/祖细胞发挥肾脏再生能力而不是瘢痕形成。Lasagni 等[31]发现抑制节段性肾小球硬化症小鼠模型的Notch通路可改善蛋白尿、减少肾小球足细胞死亡，但是会引起肾小球损伤后再生阶段祖细胞增殖的减少。所以，影响肾小球疾病发病和进展的因素之一就在于Notch通路引起的足细胞死亡和肾祖细胞提供的细胞再生之间的平衡。

小结:随着CKD发生率增高，肾脏干/祖细胞的深入研究与临床实践无疑成为肾脏病患者的福音。分离并鉴定出成体肾脏干/祖细胞的定位及特性，通过祖细胞定向分化或其他细胞类型的重新编程促进肾单位再生，寻找治疗CKD的根本有效治疗靶点和时机，仍是一项艰巨的任务。而目前仍缺乏针对成体肾脏干/祖细胞，尤其是慢性肾脏病中干/祖细胞公认的研究成果。要确定成体肾脏干/祖细胞是否真正存在，揭开其修复肾损伤机制，为临床广大肾脏疾病患者带来据实可靠的治疗方案，还需学术界的持续努力探索。

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(本文编辑 逸 沐)

Progress and controversy of specific molecular markers of adult kidney stem-progenitor cells

WUYansheng,GAOJiandong

Departmentofnephrology,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,TCMinstituteofkidneydisease,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicineShanghaiKeyLaboratoryofTraditionalChineseClinicalMedicine(14DZ2273200)，Shanghai201203,China

Many studies support the presence of adult kidney stem-progenitor cells, this area has become a new research direction in kidney damage. Many research provide proofs for adult kidney stem-progenitor cells protecting from kidney damage, but the academic circles still argue the existence of adult kidney stem-progenitor cells which promote kidney development and regeneration. A subset of CD133 and CD24 positive progenitor cells exists in adult kidney tubules and Bowman’s capsule, as the labeled molecules of adult kidney stem-progenitor cells, which provide a real possibility for injured renal tubular cell regeneration. Autologous stem-progenitor cells cultivate in vitro provide a fundamental and promising treatment potentially for patients with chronic kidney disease, especially with ESRD.

adult kidney stem-progenitor cells differentiated tubule cells Bowman’s capsule podocytes kidney regeneration

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.04.012

上海市中医药事业发展三年行动计划项目(ZYSNXD-CC-YJXYY)

上海中医药大学附属曙光医院肾病科,上海中医药大学中医肾病研究所,上海市中医临床重点实验室(上海，201203)

2016-06-30