Fascin-1对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

骆曼，李灵毅

(1 武汉市第一医院，武汉430014；2 华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院)

Fascin-1对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

骆曼1，李灵毅2

(1 武汉市第一医院，武汉430014；2 华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院)

目的 探讨Fascin-1对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法 体外培养人恶性黑色素瘤细胞A375和人皮肤成纤维细胞CCC-HSF-1。将A375细胞随机分为CON组和Fascin-1-shRNA组，分别按照10 MOI的感染复数加入CON和Fascin-1-shRNA病毒，培养48 h。采用qRT-PCR法及Western blotting法检测常规培养的CCC-HSF-1、A375细胞以及CON组、Fascin-1-shRNA组Fascin-1 mRNA和蛋白表达。分别采用Dye67染色法、Annexin V/PI染色法检测CON组、Fascin-1-shRNA组细胞增殖指数及凋亡率，采用Western blotting法检测Bcl-2、Bax、Bad蛋白表达。结果 常规培养的CCC-HSF-1、A375细胞中Fascin-1 mRNA相对表达量分别为0.21±0.015、1.00±0.01，Fascin-1蛋白相对表达量分别为0.12±0.04、0.75±0.11，二者比较P均<0.01。CON组、Fascin-1-shRNA组Fascin-1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.01 、0.19±0.04，Fascin-1蛋白相对表达量分别为1.28±0.17、0.24±0.10，两组比较P均<0.01。Fascin-1-shRNA组培养3、4天时细胞增殖指数均低于CON组同期(P均<0.05)。Fascin-1-shRNA组细胞凋亡率高于CON组(P<0.01)。Fascin-1-shRNA组Bcl-2蛋白相对表达量低于CON组，Bax、Bad蛋白相对表达量高于CON组(P均<0.01)。结论 Fascin-1表达下调可抑制恶性黑色素瘤细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调细胞中Bcl-2表达及上调Bax、Bad表达有关。

恶性黑色素瘤；Fascin-1；细胞增殖；细胞凋亡；Bcl-2家族

恶性黑色素瘤是一种由痣转变而来的皮肤恶性肿瘤[1]，近年来其发病率不断上升[2,3]。恶性黑色素瘤患者预后主要取决于是否发生淋巴结转移[4]。研究证实，恶性黑色素瘤细胞分裂速度、瘤体厚度与肿瘤侵袭和转移密切相关[5,6]。Fascin-1蛋白是一种在肌动蛋白中具有捆绑作用的蛋白，通常在上皮细胞中低表达或不表达[7,8]。研究发现，Fascin-1可改变肺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤细胞的增殖状态，并促进其迁移和侵袭[9～12]。但目前关于Fascin-1与恶性黑色素瘤发生、发展的关系鲜见报道。2015年1月～2016年1月，我们观察了Fascin-1对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人皮肤成纤维细胞系CCC-HSF-1和人恶性黑色素瘤细胞系A375，购自北京协和医学院细胞库。Fascin-1-shRNA序列：5′-ACTATAACAAGGTGGCCAT-3′，非识别对照shRNA序列(CON序列)：5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，由美国Sigma公司设计合成。Western blotting检测相关仪器，美国Bio-Rad公司；流式细胞仪、Dye670染料，美国BD公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒，天津三箭生物技术股份有限公司；Fascin-1、Bcl-2、Bax、Bad一抗，美国Cell Signal Technology公司；辣根过氧化物酶偶联二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司。慢病毒包装体系为Addgene第3代慢病毒包装系统，以空载质粒包装CON病毒，Fascin-1-shRNA包装Fascin-1-shRNA病毒，收集慢病毒包装48 h时病毒上清，PEG纯化，进行后续实验。

1.2 CCC-HSF-1、A375细胞Fascin-1表达检测 将CCC-HSF-1细胞、A375细胞接种于RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养48 h，收集两种细胞，分别检测其Fascin-1 mRNA和蛋白表达。①Fascin-1 mRNA表达：采用qRT-PCR法。按Qiagen RNeasy Mini Kit试剂盒说明提取细胞总RNA，按TaKaRa cDNA Synthesis Kit试剂盒说明将总RNA反转录为cDNA，然后进行PCR扩增。引物序列：Fascin-1上游引物：5′-AAGAAGAAGCAGATCTGGAC-3′，下游引物：5′-CACGATGAGGAAACGGCAGT-3′；GAPDH上游引物：5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG-3′，下游引物：5′-GGGACGACCTTCGATCTACC-3′。所有操作严格按TaKaRa SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明进行。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算Fascin-1 mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。②Fascin-1蛋白表达：采用Western blotting法。取两种细胞，RIPA冰上裂解30 min，BCA法蛋白定量，取部分蛋白加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴10 min，然后行SDS-PAGE，50 V恒压，待溴酚蓝跑至浓缩胶与分离胶分界处时，切换至120 V恒压；当溴酚蓝跑至胶板底部时，400 mA恒流将蛋白转印至PVDF膜上；分别加入Fascin-1(1∶200)与β-actin(1∶1 000)一抗，37 ℃孵育4 h；加入辣根过氧化物酶偶联二抗(1∶1 000)孵育过夜；ECL发光后显影。采用Quantity One 1-D软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白电泳条带灰度值/β-actin蛋白电泳条带灰度值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 转染Fascin-1-shRNA对A375细胞增殖和凋亡影响的观察

1.3.1 CON、Fascin-1-shRNA病毒转染 将A375细胞接种于RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养48 h。随机将细胞分为CON组、Fascin-1-shRNA组，按照10 MOI(病毒∶细胞=10∶1)的感染复数加入CON病毒和Fascin-1-shRNA病毒，继续培养48 h。收集两组细胞，分别采用qRT-PCR法、Western blotting法检测Fascin-1 mRNA和蛋白表达，方法同1.2。结果显示，CON组、Fascin-1-shRNA组Fascin-1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.01、0.19±0.04，Fascin-1蛋白相对表达量分别为1.28±0.17、0.24±0.10，两组比较P均<0.01。证实Fascin-1-shRNA病毒能够抑制Fascin-1表达，可进行后续实验。

1.3.2 细胞增殖指数检测 采用Dye670染色法。取CON组、Fascin-1-shRNA组转染48 h细胞，制成单细胞悬液(细胞密度为1×107个/mL)，然后加入适量Dye670染料，使其终浓度为10 μmol/L，37 ℃避光染色10 min，再加入5倍体积的完全培养基，冰上孵育5 min，完全培养基冲洗3次。将标记后的细胞接种于24孔板，每孔1×106个，37 ℃孵育，分别于培养0、1、2、3、4天时采用BD Calibur流式细胞仪检测细胞增殖指数。

1.3.3 细胞凋亡检测 采用Annexin V/PI染色法。取CON组、Fascin-1-shRNA组转染48 h细胞，制成单细胞悬液(细胞密度为1×107个/mL)，PBS清洗2次，Binding Buffer重悬，加入相应比例(1∶1 000)的Annexin V抗体避光染色10 min，然后加入适量PBS溶液及PI染液混匀，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例，即为细胞凋亡率。

1.3.4 Bcl-2、Bax、Bad蛋白表达 采用Western blotting法。一抗分别为Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、Bad(1∶200)、β-actin(1∶200)，二抗为辣根过氧化物酶偶联二抗(1∶1 000)，具体操作步骤同1.2。

2 结果

2.1 CCC-HSF-1、A375细胞Fascin-1 mRNA和蛋白表达比较 CCC-HSF-1、A375细胞Fascin-1 mRNA相对表达量分别为0.21±0.02、1.00±0.01，Fascin-1蛋白相对表达量分别为0.12±0.04、0.75±0.11，二者比较P均<0.01。

2.2 转染Fascin-1-shRNA或CON对A375细胞增殖和凋亡影响的观察

2.2.1 两组转染不同时间细胞增殖指数和细胞凋亡率比较 见表1。

表1 两组转染不同时间细胞增殖指数和细胞凋亡率比较±s)

注：与CON组比较，*P<0.05，△P<0.01。

2.2.2 两组Bcl-2、Bax、Bad蛋白表达比较 见表2。

表2 两组Bcl-2、Bax、Bad蛋白相对表达量比较

注：与CON组比较，*P<0.01。

3 讨论

Fascin-1定位于染色体7p22，可与F-肌动蛋白结合，参与调节细胞运动等[13]。Fascin-1蛋白的第39位丝氨酸是蛋白激酶C的磷酸化位点，该位点磷酸化后可调节Fascin-1蛋白与F-肌动蛋白的结合活性，抑制Fascin-1肌钙蛋白的组装功能，并影响细胞膜表面伪足和微棘形成[14]。Fascin-1在非小细胞肺癌组织中高表达，参与调节细胞增殖与迁移，并与肿瘤临床分期、淋巴结转移相关[15]。在结肠癌组织中，Fascin-1通过caspase介导的失巢凋亡，发挥癌基因作用[16]。Fascin-1在胃癌组织中高表达，是影响胃癌患者预后的独立危险因子[17]。miR-429通过靶向下调FSCN1表达抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[18,19]。Fascin-1在卵巢癌组织中高表达，且随着TNM分期升高而表达增高，可能参与卵巢癌的恶性转化[20]。以上研究说明，Fascin-1可作为癌基因参与多种恶性肿瘤的发生、发展。

本研究以人恶性黑色素瘤细胞系A375为研究对象，以人皮肤成纤维细胞CCC-HSF-1为对照，结果显示，常规培养的A375细胞Fascin-1 mRNA和蛋白相对表达量均高于CCC-HSF-1细胞，提示Fascin-1高表达可能与人恶性黑色素瘤的发生有关。进一步将A375细胞给予空载质粒包装的CON病毒和Fascin-1-shRNA包装的Fascin-1-shRNA病毒转染发现，Fascin-1-shRNA组Fascin-1 mRNA和蛋白相对表达量均低于CON组，提示慢病毒处理可敲低A375细胞Fascin-1表达；Fascin-1敲低后，A375细胞的增殖受到抑制，其凋亡率显著高于CON组，提示Fascin-1低表达可诱导A375细胞凋亡。

Bcl-2家族是目前研究最广泛的凋亡调控基因之一，包括抑制凋亡基因与促进凋亡基因两大类，抑制凋亡基因主要有Bcl-2、Bcl-w等，促进凋亡基因主要有Bax、Bad、Bid等[21]。本研究结果显示，与CON组比较，Fascin-1-shRNA组Bcl-2表达下降，Bax、Bad表达增加，表明Fascin-1对A375细胞增殖和凋亡的影响与其调控Bcl-2家族相关基因的表达有关。

综上所述，Fascin-1表达下调可抑制恶性黑色素瘤细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调Bcl-2表达及上调Bax、Bad表达有关。

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李灵毅(E-mail： 1114395480@qq.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.012

R739.5

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1002- 266X(2017)28- 0043- 03

2016-10-29)