豆腐柴提取物不同极性部位的总酚、总黄酮含量及体外抗氧化活性

孙霁寒,黄玲艳,顾嘉昌,王春宇,孙大伟,金一敏,彭 景

(扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127)

豆腐柴提取物不同极性部位的总酚、总黄酮含量及体外抗氧化活性

孙霁寒,黄玲艳,顾嘉昌,王春宇,孙大伟,金一敏,彭 景*

(扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225127)

目的:研究豆腐柴提取物不同极性部位的体外抗氧化活性。方法:用甲醇提取豆腐柴减压浓缩后得豆腐柴提取物,依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得包括水相的五个不同极性部位,测定各极性部位的总多酚、总黄酮含量,比较各极性部位清除DPPH、ABTS、FRAP自由基的能力。结果:豆腐柴提取物的不同极性部位中乙酸乙酯相的总酚、总黄酮含量最高(总酚含量(635.935±6.529) mg GAE·g-1,总黄酮含量(953.018±21.774) mg QE·g-1),各极性部位均提示有一定的抗氧化活性,且自由基清除力在一定范围呈显著的剂量效应关系,乙酸乙酯相与石油醚相、水相的抗氧化能力差异性较大(p<0.01)。结论:豆腐柴提取物各极性部位都具有一定的抗氧化活性,可能与总酚、总黄酮含量有关,乙酸乙酯相抗氧化活性强于VC,可重点对该极性部位进一步分离纯化。

豆腐柴,总酚,总黄酮,抗氧化

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz),又名观音柴,为马鞭草科豆腐柴属,广泛分布于我国华东、中南、华南以及四川、贵州等地。《本草正义》记载“腐婢味苦气寒,专主温热邪病,实热蕴结及痈疮肿毒诸症”,其中腐婢就是豆腐柴。豆腐柴属清热解毒类中药[1],Jiang等[2]研究表明清热解毒类中药存在的主要药效物质为黄酮类、多糖类等,已知与药效密切相关的黄酮类物质有槲皮素、山奈素[3]。

豆腐柴属的植物有200多种,多为药食两用,大多根、茎、叶均可入药,具有消炎、清热等一系列药效[4],由于其广泛的药理作用,临床上可用来抗癌、抗菌、抗利什曼原虫活动。因此,豆腐柴属植物在医药保健方面有广阔的前景。

目前关于豆腐柴属植物的研究多集中于豆腐柴。范超敏等研究表明豆腐柴叶含有丰富的果胶、蛋白质、氨基酸、维生素、多酚、类黄酮等成分[5]。人们普遍认为豆腐柴叶是可食用的野生蔬菜[6],民间常采集其叶以“灰水点卤”方式制作果冻[7]或煲制凉茶[8],罗兴武等也尝试将其开发成保健饮料[9]。国内外研究证实,豆腐柴具有增肌、增强免疫、抗疲劳、抗炎、抗菌、抗氧化等作用[10-13]。除此以外,Mali PY等在小鼠模型上发现豆腐柴还具有抗肥胖活性[14]。Zhang等最新研究表明豆腐柴制成的精油具有良好的细胞毒活性,可作为化妆和医药行业优质的潜在资源[15]。关于豆腐柴的研究局限于粗提物,对于抗氧化的有效部位和有效成分研究较少,本实验对豆腐柴提取物进行极性分部,测定各极性部分的总酚、总黄酮含量,比较各极性部位的总抗氧化能力、DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力,为开发利用豆腐柴作为保健食品和天然抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆腐柴 于2015年8月采自浙江浦江,干燥,粉碎,过100目筛,密封储存于4 ℃冰箱。

槲皮素标准品、没食子酸标准品 北京索莱宝科技有限公司;抗坏血酸标准品 国药集团化学试剂有限公司;二苯代苦味酰自由基(DPPH) 上海蓝季科技发展有限公司;2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸,ABTS) 阿拉丁试剂有限公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ) 南京都莱生物技术有限公司;过硫酸钾;钨酸钠;钼酸钠;硫酸锂;盐酸;冰乙酸;三氯化铁;亚硝酸钠;三氯化铝;亚硝酸钠;磷酸二氢钾;氢氧化钠;乙醇;甲醇;石油醚;三氯甲烷;正丁醇;乙酸乙酯;醋酸等试剂,均为国产分析纯。

Spectrumlab755s紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;BS224S电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;九阳料理机 九阳股份有限公司;SHB-Ⅲ型循环水真空泵,RE-52B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;D2F6020真空干燥箱 上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 称取50 g豆腐柴干粉,参照文献[16]的方法且经预实验,选用甲醇提取物测定总酚和总黄酮含量。无水甲醇(1∶5 g·mL-1)浸泡脱脂5次,每次12 h,合并提取液,旋转蒸发仪减压浓缩去甲醇后得浸膏,蒸馏水溶解,依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到,每个有机溶剂均萃取3次,得到四个有机层和水层,将各极性部位萃取液合并,分别减压浓缩、干燥至恒重(60 ℃,160 hPa),得到5个不同极性部位的浸膏,分别为石油醚浸膏2.762 g、三氯甲烷浸膏1.536 g、乙酸乙酯浸膏1.222 g、正丁醇浸膏2.350 g、水浸膏10.068 g。分别精密称取待测样品适量,用无水乙醇配制成0.1～0.8 mg·mL-1的溶液,为供试液。

1.2.2 总酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu比色法测定[17]。以没食子酸为标样,绘制标准曲线。取1 mL 0.1～1.2 mg·mL-1的没食子酸溶液和10 mL蒸馏水到25 mL容量瓶中,加入1.5 mL Folin试剂,反应5 min后加入4 mL 20% Na2CO3溶液,加蒸馏水定容至25 mL,混匀,室温避光反应40 min后于755 nm测定吸光度,以蒸馏水代替样品溶液做空白对照,得到没食子酸质量浓度Y(mg·mL-1)与吸光度A的回归方程为Y=5.4301A+0.0002(R2=0.9998),根据回归方程计算样品中的总酚含量,结果以没食子酸当量(gallic acid equivalents,GAE)表示,单位为mg GAE·g-1。

1.2.3 总黄酮含量测定 采用NaNO2-AlCl3-NaOH方法[18]。以槲皮素为标样,绘制标准曲线。取1 mL 0.06～0.30 mg·mL-1的槲皮素溶液于试管中,加入600 μL蒸馏水、300 μL 5% NaNO2溶液,混匀,避光反应6 min后,加入600 μL 10% AlCl3溶液,混匀,避光反应5 min后,加入2 mL 4%NaOH溶液,1.1 mL蒸馏水,混匀后立即于510 nm测定吸光度,以蒸馏水代替AlCl3溶液做空白对照,得到槲皮素质量浓度Y(mg·mL-1)与吸光度A的回归方程为Y=1.5709A-0.0099(R2=0.9941),根据回归方程计算样品中的总黄酮含量,结果以槲皮素当量(Quercetin equivalents,QE)表示,单位为mg QE·g-1。

1.2.4 总抗氧化能力的测定 采用FRAP法[19]。FRAP试剂的制备:300 mmol·L-1醋酸缓冲液(pH3.6)、10 mmol·L-1TPTZ(加入40 mmol·L-1盐酸)和20 mmol·L-1FeCl3溶液,按10∶1∶1混合。取100 μL待测样品,加入3.6 mL FRAP试剂、360 μL蒸馏水,充分混匀,37 ℃水浴反应60 min后于593 nm测定吸光度。

用VC做阳性对照。得到VC质量浓度Y(mg·mL-1)与吸光度A的回归方程为Y=12.448A-0.0088(R2=0.9978)。

1.2.5 DPPH·清除能力 参照文献[20]的方法,准确称取20 mg DPPH,用无水乙醇溶解使其在517 nm处吸光度为1左右。300 μL样品加入3 mL DPPH·溶液,混匀避光反应30 min,于517 nm处测定吸光度At;3 mL无水乙醇与300 μL样品混匀,测定本底吸光度Ax;3 mL DPPH·乙醇溶液与300 μL蒸馏水混匀,测定对照吸光度Ao。DPPH·自由基清除率计算公式如下:

DPPH清除率(%)=[1-(At-Ax)/Ao]×100

式(1)

以VC作标准曲线,得到VC质量浓度X(mg·mL-1)与DPPH清除率Y(%)的回归方程为Y=913.65X-2.3854(R2=0.9998)。

1.2.6 ABTS+·清除能力 参照文献[21]的方法,7 mmol·L-1ABTS+·溶液、2.45 mmol·L-1K2S2O4溶液按2∶1混匀,室温、避光反应12～16 h,作为ABTS+·储备液。使用前用pH7.4 PBS缓冲液(0.1 mol/L NaOH溶液98.75 mL加KH2PO41.7 g),蒸馏水稀释至250 mL使其在734 nm吸光度为0.700±0.002。取200 μL各样品不同浓度供试液,加入3 mL ABTS+·工作液,混匀反应10 min,于734 nm测定样品吸光度At;200 μL待测样品与3 mL PBS缓冲液混合,测定样品本底吸光度Ax。ABTS清除率计算公式如下:

ABTS+·清除率(%)=(1-At/Ax)×100

式(2)

以VC作标准曲线,得到VC质量浓度X(mg·mL-1)与ABTS+·清除率Y(%)的回归方程为Y=1217X+0.3628(R2=1.000)。

表1 豆腐柴不同极性部位的总酚、总黄酮含量Table 1 Total polyphenol,flavonoid contents of different polarity parts from Premna microphylla Turcz leaves

1.2.7 数据分析 用Excel和SPSS 16.0进行数据处理和分析,每份样品测定3次,结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 豆腐柴提取物各极性部分总酚、总黄酮的含量

根据1.2.2、1.2.3方法,测定总酚、总黄酮含量,结果见表1。

由结果可知,豆腐柴提取物各极性部分均含有总酚,总酚含量为:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>三氯甲烷相>石油醚相,总黄酮含量为:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相,石油醚相和三氯甲烷相在消除底色干扰后未能测出总黄酮。乙酸乙酯相、正丁醇相的总酚、总黄酮含量明显高于石油醚相、三氯甲烷相和水相(p<0.01),且前两者之间还有显著差异(p<0.01)。石油醚相和三氯甲烷相中总酚含量最低,且两者相近,之间无明显差异(p>0.05)。所有极性部分的总酚含量均明显高于李慎新等[22]测定的五种清热解毒类中药,可能提示豆腐柴提取物乙酸乙酯相和正丁醇相的总酚、总黄酮具有极大的研究意义。

2.2 豆腐柴提取物各极性部位的抗氧化活性

根据1.2.4方法,测定各极性部位的吸光度,结果见图1。

图1 FRAP法测得豆腐柴不同极性部位的吸光度Fig.1 The absorbance of different polar parts measured by FRAP method

抗氧化剂是通过还原作用清除自由基的,FRAP法测得的吸光度与抗氧化能力呈正相关[19],因此可根据吸光度的大小判断样品的抗氧化活性。

由图1可知,豆腐柴提取物各极性部分均有一定的抗氧化活性,且在实验剂量范围内与质量浓度存在正相关性。以VC为阳性对照,各极性部位抗氧化活性:乙酸乙酯相>VC>正丁醇相>水相>三氯甲烷相>石油醚相。这与香椿叶[23]、金樱子[24]的极性部位研究结果相一致。其中乙酸乙酯相、VC的总抗氧化能力显著高于石油醚相、三氯甲烷相和水相(p<0.01),而三氯甲烷相和石油醚相的抗氧化活性之间无明显差异(p﹥0.05),提示研究豆腐柴乙酸乙酯相的抗氧化活性较强。

2.3 豆腐柴提取物各极性部位对DPPH·的清除能力

根据方法1.2.5,测定不同极性部分对DPPH·的清除率,结果如图2。

图2 豆腐柴不同极性部位对DPPH·清除率的作用Fig.2 DPPH· removal effect of different polar parts

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基,加入自由基清除剂时,在最大光吸收处颜色变浅,吸光度变小,吸光度与自由基清除能力成负相关[20],因此可以根据吸光度判断样品抗氧化能力。

由图2可知,各极性部分萃取物对DPPH都具有一定的清除能力,且在实验剂量范围内随着浓度的升高而增加。与阳性对照组VC相比,清除能力为:乙酸乙酯相>VC>正丁醇相>水相>三氯甲烷相>石油醚相。其中,乙酸乙酯相与对照组VC的半数清除率(IC50)与正丁醇相、三氯甲烷相、石油醚相有显著差异(p<0.01),多酚与总黄酮含量最高的乙酸乙酯相比其他极性部位的DPPH清除能力都强,且半数清除率高于大蒜中的乙酸乙酯相0.5 mg/L[25]。

2.4 豆腐柴提取物各极性部位对ABTS+·的清除能力

根据方法1.2.6,测定不同极性部分对ABTS+·的清除率,结果如图3。

图3 豆腐柴不同极性部位对ABTS+·清除率的作用Fig.3 ABTS+· removal effect of different polar parts

ABTS+·呈蓝绿色,在734 nm有最大光吸收。抗氧化物质与ABTS+·作用使反应体系褪色,颜色越浅,吸光度越小,自由基清除能力越强[21],因此样品抗氧化活性越强。

由图3可知,各极性部分萃取物对ABTS+·都有一定的清除能力,与阳性对照组VC相比,清除能力为:乙酸乙酯相>VC>正丁醇相>水相>三氯甲烷相>石油醚相。其中乙酸乙酯相清除率最高且高于对照组VC,与正丁醇相、三氯甲烷相、石油醚相有显著差异(p<0.01),这与上面两个实验结果相一致。

3 结论与讨论

抗氧化活性的评价是一个系统的体系,需采用多种方法全面科学地评价一种物质的抗氧化活性[9]。本研究测定了豆腐柴提取物不同极性部位的总酚、总黄酮含量和体外抗氧化活性(DPPH·法、ABTS+·法、FRAP法),实验结果显示豆腐柴提取物各极性部位都有一定的抗氧化活性,三种方法表明抗氧化活性为:乙酸乙酯相>VC>正丁醇相>水相>三氯甲烷相>石油醚相。其中乙酸乙酯相的抗氧化能力最强,且该极性部位总酚、总黄酮含量最高,提示抗氧化活性可能与总酚、总黄酮含量有关,因此认为豆腐柴中抗氧化的有效活性成分集中在乙酸乙酯极性部位。

由于豆腐柴叶易于收集,经上述实验表明抗氧化能力高于VC,且相同浓度下,比玫瑰花、香椿叶、金樱子对自由基的清除率更高[23-24],因此可认为是天然的强抗氧化剂。为进一步明确活性成分与抗氧化机制的相关性,应着重对提取物乙酸乙酯部位尤其是总酚和总黄酮分离纯化,如参照文献[26]高效液相色谱法对酚类成分进行测定,比较各成分与抗氧化能力的相关性,为豆腐柴保健食品和天然抗氧化剂的开发提供参考。

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Total polyphenol,flavonoid contents and antioxidant capacities ofdifferent polarity parts in extracts fromPremnamicrophyllaTurczinvitro

SUN Ji-han,HUANG Ling-yan,GU Jia-chang,WANG Chun-yu,SUN Da-wei,JIN Yi-min,PENG Jing*

(College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

Objective:The antioxidant capacities of different polarity parts in extracts fromPremnamicrophyllaTurczleaves were studied. Methods:Different polarities of extracts were classified by different polarity solvents,such as petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,N-butyl alcohol and water,the content of total flavonoids was determined and the antioxidant activity was compared by FRAP,DPPH and ABTS+. Results:The contents of total phenolics and total flavonoids in the ethylacetate phase were the highest(635.935±6.529 mg GAE-1and 953.018±21.774 mg QE·g-1),all polarity parts were promoted to have a certain antioxidant activity and there was a significant dose-effect relationship,the antioxidant capacity of ethyl acetate phase and petroleum ether phase was different(p<0.01). Conclusion:The different polarity fractions of extracts fromPremnamicrophyllaTurczhad certain antioxidant abilities which were related to contents of total phenolics and total flavonoids. The free radical scavenging capacity of ethyl acetate was stronger than that of VC,it can be further separated and purified.

PremnamicrophyllaTurcz;total polyphenol;flavonoid;antioxidant capacities

2017-01-13

孙霁寒(1994-)，女，硕士研究生在读，研究方向：基础营养学，E-mail：sjhunian@163.com。

*通讯作者:彭景(1952-)，女，本科，副教授，研究方向：基础营养学，E-mail：yzupj@163.com。

江苏省扬州大学科技创新校重点资助项目(2016946)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)15-0055-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.012