改良环介导等温扩增技术在疟原虫耐药基因SNP检测中的价值及可行性

林岭海，黄良喜，刘光明

(惠州市中心人民医院药学部，广东惠州516001)

改良环介导等温扩增技术在疟原虫耐药基因SNP检测中的价值及可行性

林岭海，黄良喜，刘光明

(惠州市中心人民医院药学部，广东惠州516001)

目的探讨改良环介导等温扩增技术(LAMP)对常见药物抗性基因SNP的检测价值及可能性。方法采集非洲赤道几内亚马拉博地区医院提供的500例当地疟疾患者的外周血液样本，以巢式PCR为金标准，比较改良环介导等温扩增技术与其在恶性疟原虫耐药基因SNP检测中的反应效率、敏感性及特异性。结果对照金标准巢式PCR方法，对500例患者进行检测，两种方法的检测符合率为96.4%，差异无统计学意义(P＞0.05)。检测效率比较显示，通过与金标准进行比较，改良LAMP的初反应时间较快，在10 min内即起跳并迅速达到阳性反应阈值，而巢式PCR扩增效率相对较低，明显落后于改良LAMP(q浑浊度=6.492，P＜0.001；q反应速率=0.931，P=0.079)；敏感性比较显示，改良LAMP扩增的阳性反应阈值较巢式PCR出现得早，并且随着时间推移，反应扩增量逐渐增加，在反应的20 min内，改良LAMP反应起跳时间较早(q浑浊度=20.171，P＜0.001；q反应速率=0.326，P=0.674)；特异性比较显示，改良LAMP对四种疟原虫均有较好的特异性，无论是起跳时间、扩增产物速率均优于巢式PCR(q浑浊度=18.619，P＜0.001；q反应速率=1.927，P=0.073)。结论改良环介导等温扩增技术具有较好的反应速率、特异性及敏感性，操作简便、诊断效率高，值得推广。

恶性疟原虫；抗药性；环介导等温扩增技术

疟疾(malaria)是当今世界严重危害人类健康的公共卫生事件之一，其中已知的四种致病疟原虫中恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)致病性及致死率均最高。根据世界卫生组织数据统计，非洲撒哈拉沙漠以南地区发病率及死亡率居全球首位。目前治疗疟疾的主要手段仍是药物治疗[1]。但随着疟原虫抗药性的不断提升，现如今常用的氨基喹啉类、青蒿素类抗疟药物药效已经逐渐减弱甚至出现失效的情况[2-3]。目前的检测手段主要依赖于体外培养分子标记检测技术进行检测，但由于疟疾高发区多为经济不发达地区[4-6]，因此如何设计出简单易行、灵敏度高的疟原虫耐药性检测方法，具有一定的临床实用价值[7]。环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法，扩增后结果精确率较高，能够在传统PCR技术优势的基础上快速有效地进行相关数据的阅读[8]。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2011年1月至2014年12月非洲赤道几内亚马拉博地区医院收治的500例当地疟疾患者，采集外周血液样本，并收集血液样本提供人员的年龄、性别、症状、耐药情况等基本信息。

1.2 研究方法①疟原虫DNA提取：剪切0.5 cm× 0.5 cm滤纸血斑后加入500 μL去离子蒸馏水，反复震荡后离心(13 600 r/min，4 min)弃上清液，加入自配Chelex-100(160 μL，10%)，震荡后用56℃孵育2 h，98℃变性8 min，震荡、离心后置于4℃冷却；②合成引物合成：选取pfcrt、pfmdrl和K13-propeller[9-10]等突变位点作为本次研究对象，借助上海生工设计合成巢式PCR引物，并对恶性疟原虫患者进行抗药基因SNP检测，电泳检测条带大小剩余物由上海英俊公司进行测序；③标准品制备：根据实验所需的耐药基因及载体序列设计In-fusion克隆引物，测序验证耐药基因野生型和突变型重组质粒，经全波段酶标仪(Biotek Epoch)测定浓度，调整质粒倍比稀释为10-1～10-6μg/μL的标准液。

1.3 改良LAMP引物设计根据研究的目标耐药基因序列特点，在LAMP引物设计基础上进行适当修正：①设计中F3、B3 Tm≈60℃，FIP、BIP Tm≈65℃，扩增长度控制在150～350 bp；②突变位点依托FIP或BIP引物中F1c、B1c、F2、B2中之一的末位，突变位点前一个碱基根据引物特异性可设计为错配碱基；③根据各个基因的野生型末班设计MGB修饰的高Tm值阻滞针；④比对后确定引物特异性；⑤LAMP引物由上海生工合公司合成，运用Primer Explorer V4软件在设计LAMP引物的过程中避免含有二级结构。最终利用运用Primer Explorer V4 LAMP引物抗药基因SNP相应区域设计出4套引物序列：Pfcrt K76T、Pfmdr1 N86Y、Pfmdr1 Y184E、K13-propeller A578S，详细信息见表1。

表1 LAMP引物序列

1.4 反应体系及条件构建重组质粒和滤纸血提取的基因组DNA为模板，对抗喹啉类或青蒿素类药物基因(pfcrt、pfmdrl和K13-propeller)的SNP检测。改良后的LAMP反应参考体系为：40 mmol/L Tristan (pH 8.8)、20 mmol/L KCl、16 mmol/L MgSO4、0.20% Tween-20、20 mmol/L(NH4)2SO4、1.6 mol/L Betaine、2.8 mmol/L each dNTPs、1 mmol/L MnCl2、50 μmol/L钙黄绿素、40 pmol FIP、40 pmol BIP、10 pmol F3、10 pmol B3、20 pmol Block probe、8 U Bst DNA polymerace、20 ng DNA template，灭菌过滤后蒸馏水25 μL。反应条件控制为95℃5 min、60℃60 min、80℃5 min后终止反应。利用正交设计软件控制模板、镁离子浓度、引物、反应温度计时间，促使引物融合。

1.5 效果评价以巢式PCR(巢式PCR检测体系(NP-1993体系)为金标准[11]，比较改良LAMP对疟原虫耐药基因SNP检测的特异性、敏感性，同时对其应用的可行性进行探究。

1.6 统计学方法应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，方差齐性计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两组间检测效率、敏感性、特异性比较均采用时间序列分析(ARIMA模型)，计数资料比较采用配对χ2检验，有序资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 改良LAMP检测结果比较对照金标准巢式PCR方法，对500例患者进行检测，两种方法的检测符合率为(455+27)/500×100%=96.4%，经配对χ2检验(McNemar检验)，两种方法检测效果差异无统计学意义(P=0.815)，见表2。

表2 两组检测方法结果比较(例)

2.2 检测效率比较改良LAMP浑浊度与反应速率差异有显著统计学意义(q=4.992，P＜0.001)，金标准浑浊度与反应速率差异有显著统计学意义(q=5.691，P＜0.001)，改良LAMP通过与金标准进行比较，浑浊度差异有显著统计学意义(q=6.492，P＜0.001)，但反应速率差异无统计学意义(q=0.931，P＜0.079)，说明改良LAMP的初反应时间较快在10 min内即起跳并迅速达到阳性反应阈值，而巢式PCR扩增效率相对较低，明显落后于改良LAMP，见表3。

表3 两组检测效率比较(%)

表3 两组检测效率比较(%)

组别改良LAMP浑浊度反应速率金标准浑浊度反应速率例数500反应初反应10 min 反应20 min 反应30 min 反应40 min 反应1 h 0 0 0 0 0.15±2.00 0.05±1.92 0.41±1.43 0.25±0.91 0.69±1.55 0.05±1.43 0.81±1.33 0.03±1.96 0.92±1.93 0.02±0.81 500 0 0 0 0 0.01±1.92 0.01±0.13 0.11±0.89 0.10±1.22 0.52±1.38 0.03±1.51

2.3 敏感性比较改良LAMP浑浊度与反应速率差异有显著统计学意义(q=12.955，P＜0.001)，金标准浑浊度与反应速率差异有显著统计学意义(q= 16.848，P＜0.001)，改良LAMP通过与金标准进行比较，浑浊度差异有显著统计学意义(q=20.171，P＜ 0.001)，但反应速率差异无统计学意义(q=0.326，P= 0.674)，说明改良LAMP扩增的阳性反应阈值较巢式PCR出现得早，并且随着时间推移，反应扩增量逐渐增加，在反应的20 min内，改良LAMP反应起跳时间较早，见表4。

表4 两组敏感性比较(%，

表4 两组敏感性比较(%，

反应初反应10 min 反应20 min 反应30 min 反应40 min 反应1 h组别改良LAMP浑浊度反应速率金标准浑浊度反应速率例数500 0.1±0.13 0.1±1.92 0.51±1.13 0.33±1.10 0.63±1.54 0.07±2.10 0.80±1.90 0.03±1.22 0.91±1.04 0.01±0.13 500 0 0 0 0 0 0 0 0 0.12±1.62 0.21±1.19 0.45±1.22 0.06±1.95 0.64±1.91 0.04±1.83

2.4 特异性比较分别用两种方法对恶性疟原虫进行了检测并得出浑浊度、反应速率，改良LAMP浑浊度与反应速率差异有显著统计学意义(q=8.560，P＜0.001)，金标准浑浊度与反应速率差异有显著统计学意义(q=13.493，P＜0.001)，改良LAMP通过与金标准进行比较，浑浊度差异有显著统计学意义(q=18.619，P＜0.001)，但反应速率差异无统计学意义(q=1.927，P= 0.073)，说明结果可以看出改良LAMP对四种疟原虫均有较好的特异性，无论是起跳时间、扩增产物速率均优于巢式PCR，见表5。

表5 两组特异性比较(%

表5 两组特异性比较(%

组别改良LAMP浑浊度反应速率金标准浑浊度反应速率例数500反应初反应10 min 反应20 min 反应30 min 反应40 min 反应1 h 0.1±0.12 0.1±1.90 0.51±1.22 0.39±1.44 0.62±1.90 0.62±1.42 0.78±1.2 0.03±1.10 0.88±1.02 0.01±0.61 500 0 0 0 0 0 0 0 0 0.05±1.92 0.06±1.22 0.41±1.13 0.21±1.92 0.61±1.90 0.01±1.73

3 讨论

赤道几内亚共和国地处非洲中部，属热带雨林气候，是全世界最不发达的国家之一，卫生、经济条件较差，疟疾盛行。而其中疟原虫滋生是该地区疟疾大范围暴发的主要原因[12]。青蒿素是祖国医学通过现代药物萃取技术对其进行提纯的一类高效、低毒、副作用小的新型抗疟药物，同时因其对疟疾具有良好的治疗效果，现已被推荐为治疗疟疾的首选药物[13]。2000年后随着疟疾发病率逐渐被人类所控制，人们对疟疾的成因及治疗有了更加深刻的理解，但单方面使用青蒿素会造成疟原虫对其敏感度的减低，部分地区甚至出现了耐药患者[14]，一旦以青蒿素为主的联合用药失去了效应，则会出现大规模的疟疾暴发，最终导致大量的死亡。因此，如何对恶性疟原虫的抗药性进行监控，是当今疟疾治疗领域的一大重点研究方向。近年来随着分子生物学技术的不断发展，人们对恶性疟原虫抗药性研究获得了新的突破，多种证据表明恶性疟原虫抗药与其单核酸多态性(SNP)密切相关，并通过SNP作为疟原虫抗药性的重要标志物[15]，寻找一种能够有效、快速进行疟原虫耐药基因SNP检测的方法是进行疟原虫抗药性监控的有效途径。

近年来随着人们对LAMP的研究不断深入，让其在疟原虫SNP检测方面也有了一定的成效，国外部分学者对LAMP进行了优化，例如Iwasaki率先使用LAMP方法分析细胞色素中3种等位基因型[16]。Badolo等[17]通过改进Allele specific LAMP从而提高基因突变检出率。目前，国内外尚无任何基于LAMP平台的疟原虫耐药基因SNP检测的相关报道。

本研究针对性地设计合成巢式PCR引物，对恶性疟滤纸血样本6个耐药蛋白的31个位点突变情况进行分析，从中选出Pfcrt、Pfmdr1、K13-propeller基因的4个关键点位进行实验研究对比，对改良LAMP与巢式PCR技术对于疟原虫耐药基因SNP检测的扩增效率、检测特异性和敏感性进行了比较，采用浊度仪分别用改良LAMP及巢式PCR进行检测，结果显示改良LAMP与巢式PCR检测符合率为(455+27)/500× 100%=96.4%，比较差异无统计学意义(P＞0.05)，表明改良后的LAMP检测结果与金标准一致，均具有良好的准确性。改良LAMP的扩增效率远高于巢式PCR，扩增速率较为均匀，可20 min内起跳并迅速达到阳性反应阈值，改良后的LAMP阳性检出率与金标准比较相差不多，但金标准(巢式PCR)反应时间要略逊色于改良后的LAMP，同时从研究的阳性反应阈值时间来看，改良LAMP的敏感性要更加优越，同时对反应的最低原虫密度角度分析改良后的LAMP敏感性较巢式PCR要高出10倍左右。文章研究的改良LAMP能够提高LAMP的单个碱基突变检测，从而通过改变引物设计提高SNP检测的特异性，通过进行深层次的抗药性基因筛查，能够提前对抗药性疟原虫的大规模增殖提供坚实有力的基础技术保障，建立一种便捷、有效的抗药性检测代替传统的药敏实验，并进行快速的抗药性筛查，应用市场较为广阔。

改良后的LAMP具有敏感性强、特异性高、操作简便、诊断效率高等特点，为恶性疟原虫抗药基因SNP诊断研究弥补了此方面的空白，同时能够降低筛查的漏诊率和误诊率，有效地对患者疟原虫抗药性进行实时诊断，为临床合理用药提供有效证据。由于其操作简单、能够迅速做出诊断，因此值得在临床上推广应用。但是需要注意的是该方法在对单一虫种感染还是混合感染做鉴别时比复合PCR要复杂，且用到的Bst DNA聚合酶价格偏高，成本要略高于巢式PCR；此外，由于改良后的LAMP敏感性较高，被污染后容易造成假阳性，因此提取DNA与LAMP反应需要区分开区域开展，避免出现交叉污染而影响检测结果，若需要检测的样品数量较大时，可以每10个阳性样品间设计1个阴性对照，让结果更为可信。

[1]Organization WH.Global report on antimalarial drug efficacy and drug resistance 2000-2010[J].Switzerland:WHO Press,2010,6(4): 1-15.

[2]Vogel G.Infectious disease.The genetics of resistant malaria[J].Science,2014,346(6215):1276-1277.

[3]Mitto O,Amato R,Ashley EA,et al.Genetic architecture of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum[J].Nat Genet,2015,47(3): 226-234.

[4]Ashley EA,Dhorda M,Fairhurst RM,et al.Spread of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria[J].N Engl J Med,2014, 371(5):411-423.

[5]Torrentino-Madamet M,Fall B,Benoit N,et al.Limited polymorphisms in K13 gene in Plasmodium falciparum isolates from Dakar, Senegal in 2012-2013[J].Malar J,2014,13:472.

[6]Conrad MD,Bigira V,Kapisi J,et al.Polymorphisims in K13 and falcipain-2 associated with artemisinin resistance are not prevalent in Plasmodium falciparum isolated from Ugandan children[J].PloS One,2014,9(8):c105690.

[7]Han ET.Loop-mediated isothermal amplification test for the molecular diagnosis of malaria[J].Expert Rev Mol Diagn,2013,13(2): 205-218.

[8]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].NucleicAcids Res,2000,28(12):E63.

[9]Ariey F,Witkowski B,Amaratunga C,et al.A molecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria[J].Nature,2014, 505(7481):50-55.

[10]Straimer J,Gnadig NF,Witkowski B,et al.Drug resistance.K13-propeller mutations confer artemisinin resistance in Plasmodium falciparum clinical isolates[J].Science,2015,347(6220):428-431.

[11]Snounou G,Viriyakosol S,Zhu XP,et al.High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction[J].Mol Biochem Parasitol,1993,61(2):315-320.

[12]Rehman AM,Mann AG,Schwabe C,et al.Five years of malaria control in the continental region,Equatorial Guinea[J].Malar J,2013,7 (12):154.

[13]Li J,Chen J,Xie D.Monte-Nguba SM,et al.High prevalence of pfmdr1 N86Y and Y184F mutations in Plasmodium falciparum isolates from Bioko Island,Equatorial Guinea[J].Pathog Glob Health,2014, 108(7):339-343.

[14]Overgaard HJ,Reddy VP,Abaga S,et al.Malaria transmission after five years of vector control on Bioko Island,Equatorial Guinea[J]. Parasit Vectors,2012,5:253.

[15]Zhan XH,Zha GC,Jiao JW,et al.Rapid identification of apolipoprotein E genotypes by high-resolution melting analysis in Chinese Han andAfrican Fang population[J].Exp Ther Med,2015,9(2):469-475.

[16]Didelot A,Le Corre D,Luscan A,et al.Competitive allele specific TaqMan PCR for KRAS,BRAF and EGFR mutation detection in clinical formalin fixed paraffin embedded samples[J].Exp Mol Pathol,2012,92(3):275-280.

[17]Badolo A,Okado K,Guelbeogo WM,et al.Development of an allele-specific,loop-mediated,isothermalamplificationmethod (AS-LAMP)to detect the L1014F kdr-w mutation in Anopheles gambiae s.l.[J].Malar J,2012,11:227.

Value and feasibility of improved loop-mediated isothermal amplification technique in the detection of SNPs of Plasmodium falciparum resistance gene.

LIN Ling-hai,HUANG Liang-xi,LIU Guang-min.Department of Pharmacy, Huizhou Center People's Hospital,Huizhou 516001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the value and possibility of the SNP detection of the common drug resistance gene by the improved loop-mediated isothermal amplification(LAMP)technique.MethodsA total of 500 peripheral blood samples collected from the local malaria patients in the hospitals of Malabo area of African Equatorial Guinea,using nested PCR as the gold standard,was used to evaluate the reaction efficiency,sensitivity and specificity of the improved loop mediated isothermal amplification technology in the detection of SNPs of Plasmodium falciparum resistance gene.ResultsThe coincidence rates of the two methods in 500 patients were 96.4%,and the difference was not statistically significant(P＞0.05).The comparison of the detection efficiency showed that the initial reaction time of the modified LAMP was faster than that of the nested PCR amplification and reaches the positive reaction threshold quickly in 10 mins,and the nested PCR amplification efficiency was relatively low,significantly behind the improved LAMP(qTurbidity=6.492,P＜0.001;qReactionrate=0.931,P=0.079).The sensitivity comparison showed that the positive response threshold of modified LAMP amplification appeared earlier than nested PCR,and the reaction amplification gradually increased with time.The take-off time of the improved LAMP was early in 20 min(qTurbidity=20.171,P＜0.001,qResponserate= 0.326,P=0.674).The specificity results showed that the modified LAMP had good specificity for the four kinds of malaria parasites,both the take-off time and the rate of the amplified products were better than the nested PCR(qTurbidity= 18.619,P＜0.001;qReactionrate=1.927,P=0.073).ConclusionThe improved LAMP technology has the advantages of better reaction rate,specificity and sensitivity,easy operation and high diagnostic efficiency,which is worthy of promotion.

Plasmodium falciparum;Drug resistance;Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.019

R382.3+1

A

1003—6350（2017）15—2474—04

2017-05-09)

广东省自然科学基金（编号：1614050000695）

林岭海。E-mail：2735858141@qq.com