高效液相色谱同时测定水产品中7种磺胺类药物残留的方法改进

□ 区敏霞 佛山市高明区农业技术服务推广中心

高效液相色谱同时测定水产品中7种磺胺类药物残留的方法改进

□ 区敏霞 佛山市高明区农业技术服务推广中心

目的：本方法是在农业部公告的标准方法的基础上改进，缩短检测时间，提高检测效率。方法：样品经过乙酸乙酯提取、正己烷脱脂和HLB固相萃取小柱净化后，采用agilentXDB-C18色谱柱，以甲醇-乙腈-乙酸为流动相洗脱分离后，经过DAD检测器分析、外标法定量。结果：7种磺胺类药物能有效分离，本实验室所建立的高效液相色谱紫外法测定水产品中7中磺胺类药物残留的检测方法，对比国标法缩短了分析时间。

磺胺类药物；高效液相色谱；固相萃取；检 出限；回收率

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是应用最早的一类人工合成抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、吸收迅速完全和价格低廉等特点，在水产养殖中应用广泛[1]，由于SAs在动物体内的作用时间和代谢时间较长，容易造成动物组织中SAs残留，人们食用该类药物残留的水产品后会出现急性或慢性中毒，能够产生泌尿、免疫和造血系统紊乱的副作用，危害人类健康，造成环境污染，严重影响我国水产品出口，造成巨大的经济损失。为保障人类健康，各国对SAs残留量限制越来越严格，我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定SAs总量不得超过100 ng/ mL。加强对水产品中磺胺类药物残留的监测，对保护消费者健康，保障水产品的进出口贸易具有重要意义。目前，水产品中磺胺类药物残留的检测方法，文献报道有酶联免疫法[2]、胶体金免疫层析法[3]、高效液相-柱后衍生荧光色谱法[4]、高效液相色谱-紫外光谱法[5]、高效液相色谱-质谱法[6]等。由于高效液相色谱仪的普及，相较高效液相色谱-质谱方法，高效液相色谱法成本较低，易于推广。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

磺胺类药物标准品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺5-甲氧嘧啶（SMD）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺6-甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲基异恶唑（SMZ）、磺胺异恶唑（SFZ）、磺胺二甲氧哒嗪（SDM）、磺胺喹噁啉（SQX），纯度均大于98.0%，均购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

主要试剂：乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、正己烷（色谱纯），以上试剂均为德国Merck公司；冰乙酸（优级纯）。

固相萃取柱（Waters Oasis HLB，60mg/3mL）。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（配备DAD检测器Agilent1200，美国安捷伦公司）；电子天平（感量0.000 1 g，TP214，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电子天平（感量0.01常熟市双杰测试仪器厂）；均质机（8 000～30 000 r/ min，德国IKA 型号T10 B）；离心机（5 000r/min德国希格玛公司3K15）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE-5286A）； 涡混匀器（德国Heidolph型号Multi Reax）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水仪（美国Millipore公司Direct-Q3）；固相萃取装置（美国Supelco公司）；移液器（量程0.5～5 mL，Thermo；100～1 000 μL，20～200 μL，芬兰百得）。

1.3 主要溶液配制

（1）标准储备液配制。精密称取7种磺胺类药物各（10±0.01）mg，用甲醇分别溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中，各种磺胺标准储备液浓度为1 000 μg/mL。避光冷藏保存6个月。

（2）混合标准工作液10 μg/mL的配制。分别准确移取各种磺胺储备液1 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，冷藏避光保存1个月。

（3）混合标准使用液的配制。准确取适量混合标准工作液，流动相初始比例稀释并定容5 mL。依次配制成0.1、0.5、1.0、2.0 μg/mL的梯度浓度，现用现配。

1.4 色谱条件

检测波长：270 nm，柱温：40 ℃，流速：0.6 mL/min，进样量：50 μL；色谱柱：XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm ID，5 μm，agilent公司）；流动相A：2%乙酸-水溶液；流动相B：乙腈；流动相C：甲醇。

流动相梯度见表1。

1.5 测定方法

1.5.1 样品的提取

准确称取常温样品（5.00±0.02）g于50 mL离心管中，加入25 mL乙酸乙酯，超声提取1 min，加入5 g无水硫酸钠，14 000 r/min均质1 min，旋涡混匀1 min，5 000 r/min离心5 min，将乙酸乙酯层转移到100 mL梨形瓶中。再向原离心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋涡混匀1 min，5 000 r/min离心5 min，将乙酸乙酯层合并于100 mL梨形瓶中，于30 ℃水浴中旋转蒸发至近干。

表1 流动相梯度表

表2 7种磺胺药物的线性范围、标准曲线回归方程及相关系数表

表3 鱼肉样品中7种磺胺药物的添加平均回收率表

1.5.2 净化

先用1 mL甲醇溶解上述残渣，再加入2 mL 1%乙酸溶液，涡旋混匀，超声1 min，转移到新的50 mL离心管中，再向梨形瓶中加入1 mL甲醇和2 mL 1%乙酸溶液，重复上述操作。向离心管中加入8 mL正己烷，低速混匀，8 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷层，加入8 mL正己烷重复操作一次，下层加水6 mL稀释，待过固相萃取柱。

1.5.3 固相萃取过程

HLB固相萃取柱的平衡：依次用3 mL甲醇、6 mL纯水处理；上样：将试样稀释液以0.6 mL/min速度流过HLB小柱；洗涤：依次用3 mL水、2 mL 5%甲醇淋洗小柱；洗脱：最后用10 mL甲醇洗脱，流速不超过0.6 mL/min；收集洗脱液：洗脱液于30 ℃水浴中旋转蒸发至干，用1 mL流动相的初始比例定容，过0.2 μm有机膜，供液相色谱测定。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制定

在1.4的色谱条件下对配制标准系列溶液进样测定并绘制标准曲线，见表2，标准品色谱图参见图1。

结果表明，7种磺胺类药物的标准溶液在浓度为0.1～2.0 μg/mL，色谱峰面积与浓度之间呈良好的线性关系，相关系数均不小于0.995。

2.2 方法的回收率

向鱼肉空白中添加40、80 μg/ kg7种磺胺类标准物质，每个水平设4个平行对照组。分别称取鱼样（5.00±0.02）g，添加一定体积的标准工作液，涡旋0.5 min，混匀后静置15 min，按样品前处理方法处理后做HPLC分析。根据各组分的峰面积。空白样品添加色谱图见图2，计算相应浓度的回收率见表3。

2.4 色谱条件的选择的选择

参照农业部958号公告-12-2007[7]标准，实验中采用XDB-C18柱，比较不同比例的2%乙酸溶液+甲醇+乙腈梯度洗脱，结果表明按照表1的流动相的浓度配比，7种磺胺类药物均能达到基线分离，峰型尖锐，对称性好，而且出峰时间也得到缩短，缩短整个运行时间，提高分析效率。

图1 7种磺胺类药物浓度为1.0 μg/mL的标准色谱图

图2 添加量为40 μg/kg的样品色谱图

3 结论

本实验在农业部公告958-12-2007的标准方法的基础上通过对色谱条件的改进建立高效液相色谱法测定水产品中7种磺胺类药物的分析方法，该方法与国标方法比较，整个梯度洗脱运行时间只需要16min，7种磺胺类药物均能达到基线分离，峰型尖锐，对称性好，缩短了分析时间，减少有机溶剂的使用，同时结果线性良好，回收率也满足分析要求，可用于日常对水产品中磺胺类药物的监控检测。

[1]巢磊.磺胺类药物在水产养殖中的应用[J].水生态学杂志,2002,22(3):50-51.

[2]林品言,杜红梅.酶联免疫法快速检测水产品中磺胺类药物残留[J].当代水产, 2016, 41(10):94-95

[3]谢瑜杰,呼秀智,孙晓铮,等.胶体金免疫层析技术在水产品磺胺类药物残留检测中的应用研究进展[J].食品安全质量检测学报,2017,8(2):375-379.

[4]郑斌,余海霞,杨会成,等.高效液相色谱-在线柱后衍生荧光检测法同时测定水产品中14种磺胺类药物残留[J].食品科学,2012,33(4):230-233.

[5]徐维海,林黎明,朱校斌,等.水产品中14种磺胺类药物残留的HPLC法同时测定[J].分析测试学报,2004,23(5):122-124.

[6]赵鹏,刘鑫,孙希彦,等.HPLCMS/MS法测定水产品中14种磺胺类药物[J].食品研究与开发,2013(23):80-83.

[7]中华人民共和国农业部.农业部958号公告-12-2007 水产品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱法 中华人民共和国国家标准[S].北京:中国国家标准出版社,2007.