连翘苷拮抗环磷酰胺所致小鼠免疫抑制的实验研究①

于晓东 王立辛

(锦州医科大学附属第一医院,锦州121001)

连翘苷拮抗环磷酰胺所致小鼠免疫抑制的实验研究①

于晓东 王立辛②

(锦州医科大学附属第一医院,锦州121001)

目的：研究连翘苷对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的影响。方法：以腹腔注射环磷酰胺法复制小鼠免疫抑制模型，试验组小鼠分别按50、100、150 mg/kg剂量灌胃连翘苷，同时设模型组和对照组(等体积生理盐水灌胃)，连续处理7 d。常规方法测定胸腺和脾的脏器系数，FITC微球法测定腹腔巨噬细胞吞噬功能，ELISA法检测外周血IL- 2、IL- 4和外周血淋巴细胞cAMP含量，分析不同剂量的连翘苷对免疫抑制小鼠上述指标的影响。结果：7 d后成功建立免疫抑制小鼠模型。连翘苷能够不同程度地提高免疫抑制小鼠的免疫器官指数、巨噬细胞吞噬能力和血清中免疫因子含量，降低外周血淋巴细胞中cAMP含量。结论：连翘苷能够抵抗环磷酰胺的免疫抑制作用，具有一定的免疫调节功能。

连翘苷；小鼠；免疫抑制

连翘(Forsythia)又名旱莲子、落翘等，为木犀科植物连翘的果实，具有清热解毒、消肿散结和通经止痛的功效，现代中医研究发现，连翘提取物在抗菌消炎、抗肿瘤等方面都有一定疗效[1]。通过中药提取技术发现，连翘的活性成分有五环三萜类、挥发油、多糖和各种苷类等，其中连翘苷(Phillyrin，Ph)是连翘的重要活性成分，是连翘的质量鉴定标准，相关研究显示，连翘苷具有抗氧化和降血脂的功效，还可以作为保健性食品用于抗衰老和减肥，但关于连翘苷影响免疫功能的研究未见报道[2]。环磷酰胺是临床上常用的肿瘤化疗药物，具有细胞毒性作用，对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤选择性不高，对免疫系统抗原敏感性小淋巴细胞的DNA合成有很强的抑制作用，限制其转化为免疫母细胞及相关效应细胞，引起机体免疫抑制，病人表现为衰弱和反复感染[3- 5]。虽然近年肿瘤的生物治疗发展迅速，但受多方限制仍是研究性治疗手段，采用综合疗法仍是目前首选的治疗方案，因此，在化疗的同时使用能拮抗环磷酰胺免疫抑制作用的药物，对提高机体的免疫力具有重要的意义。为了今后更好地对连翘开发利用，本研究利用环磷酰胺所致免疫抑制小鼠，通过检测脾脏和胸腺的器官质量、腹腔巨噬细胞吞噬能力、外周血免疫因子含量以及外周血淋巴细胞cAMP含量，对连翘苷的免疫调节效应进行初步研究，以期对连翘苷协同化疗药物治疗肿瘤和相关药理学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 高纯度连翘苷(Ph)购于南京道斯夫生物科技有限公司；注射用环磷酰胺(CTX)(H32020857)购于江苏恒瑞医药股份有限公司；RPMI1640 培养基购于赛默飞世尔公司； IL- 4 ELISA试剂盒、IL- 2 ELISA试剂盒购于Sigma- Aldrich公司； FITC荧光微球购于汉诺生物；cAMP Activity Assay Kit试剂盒购于北京博迈斯；Alpha- 1506 型紫外可见分光光度计购于上海谱元仪器有限公司；Synergy H1型酶标仪购于BioTeK 公司。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠分组及免疫抑制模型的制作 SPF级昆明小鼠100只，购于锦州医科大学生命科学研究院，合格证编号：SCXK(辽)2014- 0004，雌雄各半，体重20～22 g，适应饲养7 d，将小鼠随机分成 5 组，每组20只,即正常对照组、模型组和给药组(高、中、低剂量组),正常组每天灌胃生理盐水0.3 ml 和腹腔注射生理盐水 0.3 ml；模型组每天灌胃生理盐水0.3 ml和腹腔注射CTX；3个给药组每天分别灌胃0.3 ml不同浓度的Ph，同时腹腔注射CTX，连续处理7 d，具体剂量和处理方法见表1。

1.2.2 免疫器官脏器指数的测定 处理7 d后，每组处死5只小鼠，称体重，尸体经75%乙醇浸泡 3 min，于超净工作台内剥取脾脏、胸腺，剥净连带的系膜和脂肪，称器官重，计算脏器指数。脏器指数(mg/g)=器官质量/体质量。

表1 实验动物分组及处理

Tab.1 Experimental animal grouping and processing

GroupsDrugtreatmentDose(mg/kg)ControlgroupSaline-ModelgroupCTX20Low-dosegroupCTX+Ph20+50Medial-dosegroupCTX+Ph20+100High-dosegroupCTX+Ph20+150

1.2.3 腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定 处理7 d后，每组处死5只小鼠，尸体经75%乙醇浸泡 3 min，于超净工作台内用常规方法获得腹腔巨噬细胞，细胞贴壁纯化后给药1 h，FITC荧光微球经过1% BSA孵育30 min后，超声5 min，按微球：细胞30∶1的比例加入到细胞中，吞噬15 min后，吸去培养基，用PBS清洗3次，胰酶消化5 min，除去细胞表面的微球，吸去消化液，加入5 mmol/L的EDTA消化15 min左右，轻轻吹打，PBS清洗1次，荧光显微镜镜检计数。吞噬率(%)=(吞有FITC微球的巨噬细胞数/巨噬细胞总数)×100，吞噬指数=被吞噬的FITC微球数/巨噬细胞总数。

1.2.4 外周血 IL- 2、IL- 4 的测定 处理7 d后，每组选择5只小鼠，断头取血，3 000 r/min 离心10 min，取上层血清，按ELISA试剂盒的说明操作，检测各组小鼠血清中IL- 2 和IL- 4 水平。

1.2.5 外周血淋巴细胞cAMP含量 的测定 处理7 d后，每组选择5只小鼠，断头取血，加入等量PBS，常规梯度密度离心法分离淋巴细胞，按照参考文献[14，15]的方法对细胞进行处理，按照试剂盒说明测定淋巴细胞内cAMP含量。

2 结果

2.1 连翘苷对免疫器官指数的影响 试验结果见表2。与对照组相比，模型组胸腺指数、脾脏指数均显著降低(P<0.01)，说明因为环磷酰胺的抑制导致免疫器官出现了萎缩，模型复制成功。与模型组相比，连翘苷低剂量组胸腺指数升高且差异具有显著统计学意义(P<0.05)，中、高剂量组达到差异具有极显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，连翘苷低、中剂量组的脾指数升高差异具有显著统计学意义(P<0.05)，高剂量组差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。

表2 连翘苷对免疫器官指数的影响

Tab.2 Phillyrin effects on immune organ index

ItemControlgroupModelgroupLow-dosegroupMedial-dosegroupHigh-dosegroupThymusindex3.99±0.131.67±0.141)1.97±0.142)2.76±0.043)3.85±0.113)Spleenindex0.53±0.720.35±0.031)0.38±0.060.44±0.060.45±0.043)

Note：Vs control group,1)P<0.01；vs model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表3 连翘苷对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

Tab.3 Phillyrin effects on phagocytic function of macrophages

ItemControlgroupModelgroupLow-dosegroupMedial-dosegroupHigh-dosegroupPhagocytosisrate(%)41.27±4.3129.56±3.521)32.51±3.142)34.17±4.222)39.52±3.893)Phagocyticindex0.51±0.070.37±0.041)0.41±0.060.46±0.052)0.45±0.042)

Note：Vs control group,1)P<0.01；vs model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表4 连翘苷对血清IL- 2、IL- 4含量的影响

Tab.4 Phillyrin effects on content of serum IL- 2,IL- 4

Item(pg/ml)ControlgroupModelgroupLow-dosegroupMedial-dosegroupHigh-dosegroupIL-229.59±2.516.22±1.691)17.02±1.4916.61±3.3721.93±2.192)IL-435.16±3.6820.99±2.311)24.07±2.2830.33±4.012)34.94±5.492)

Note：Vs control group,1)P<0.01;vs model group,2)P<0.01.

表5 连翘苷对外周血淋巴细胞cAMP含量的影响

Tab.5 Phillyrin effects on content of cAMP in peripheral blood lymphocytes

Item(pmol/ml)ControlgroupModelgroupLow-dosegroupMedial-dosegroupHigh-dosegroupcAMP1.25±0.033.68±0.221)3.44±0.233.52±0.222.28±0.252)

Note：Vs control group,1)P<0.01;vs model group,2)P<0.01.

2.2 连翘苷对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 试验结果见表3。与对照组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能(吞噬率和吞噬指数)降低，差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，连翘苷处理组巨噬细胞的吞噬率依浓度高、中、低剂量组差异具有显著统计学意义(P<0.05)，高剂量组差异具有极显著统计学意义(P<0.01)；低剂量组吞噬指数升高差异具有显著统计学意义(P<0.05)，中、高剂量组吞噬指数升高差异具有显著统计学意义(P<0.05)。

2.3 连翘苷对外周血 IL- 2、IL- 4含量的影响 试验结果见表4。与对照组相比，模型组血清中IL- 2 和IL- 4含量显著降低(P<0.01)。与模型组相比，低、中剂量组IL- 2含量升高差异具有显著统计学意义(P<0.05)，高剂量组含量升高且差异具有极显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，低剂量组IL- 4含量升高差异具有显著统计学意义(P<0.05)，中、高剂量组含量升高且差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。

2.4 连翘苷对外周血淋巴细胞cAMP含量的影响 试验结果见表5。与对照组相比，模型组外周血淋巴细胞cAMP含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，连翘苷低、中剂量组cAMP含量降低，但差异具有显著统计学意义(P>0.05)，高剂量组含量降低且差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

3.1 连翘苷对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响 由于环磷酰胺能够抑制免疫细胞的分化，降低免疫器官淋巴细胞数量，所以胸腺和脾脏器官指数在一定程度上可反映机体整体免疫水平。本研究显示，连翘苷可以改善环磷酰胺所致的器官萎缩，提高胸腺指数和脾脏指数，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，这与许珊丽等[6]、孙佳玮等[7]、张岫秀等[8]的报道相似，说明连翘苷可以促进胸腺和脾脏中免疫细胞的成熟和分化，增加细胞总量，提高机体免疫力。

3.2 连翘苷对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 巨噬细胞可吞噬异体抗原和自身坏死组织，分泌多种免疫因子，也能向T细胞提呈抗原，是机体天然免疫的重要组成部分，巨噬细胞的吞噬能力是其功能最直接的体现。古秋莉等[9]报道，选用的中药方剂能有效提高免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬百分率、廓清指数和吞噬系数，差异具有统计学意义；尹乐乐等[10]报道，连翘提取物能增强小鼠腹腔巨噬细胞体外对大肠杆菌的吞噬和NO的释放，并表现出剂量效应关系；张永红等[11]报道，丁香酯苷能够促进小鼠腹腔、肝脏和骨髓内巨噬细胞的增殖，增强其分泌和吞噬能力，减轻LPS对机体的作用[11]。本研究连翘苷处理组的巨噬细胞吞噬率、吞噬指数升高，与模型组相比都达到差异具有显著统计学意义(P<0.05)，与上述报道相近，可能是选用方剂中都含有苷类组分的原因，说明连翘苷能拮抗环磷酰胺的毒性作用，提高巨噬细胞的吞噬活性，增强机体天然免疫功能。

3.3 连翘苷对免疫抑制小鼠外周血免疫因子含量的影响 免疫调节因子主要是由免疫细胞分泌，在不同免疫细胞间相互作用、传递信息，具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽，IL- 2是由Th1型细胞分泌的广泛生物活性细胞因子，可促进T细胞增殖，也参与抗体反应，IL- 4由Th2型细胞分泌，能促进 T、B 淋巴细胞分化，增强细胞免疫和体液免疫水平，多种免疫因子与免疫细胞间构成复杂的调控网络。Zhu等[12]报道，从芍药根提取的苷类物质能够促进环磷酰胺所致免疫抑制小鼠TNF- α、IL- 3和IL- 6等因子的释放，恢复骨髓的免疫功能；余树民等报道，包括连翘在内的14味中药方剂可显著提高免疫抑制模型小鼠血清中IgG和IgM含量，提高IL- 2、IL- 4和INF- γ含量并且促使其恢复或接近正常水平[13]。本研究得到类似结果，说明连翘苷能够促进免疫抑制小鼠IL- 2和IL- 4的分泌，并间接影响免疫细胞的增殖分化以及免疫网络的调控。

3.4 连翘苷对免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞内cAMP含量的影响 cAMP作为细胞内的第二信使广泛参与各种信号通路的调控过程，一般认为，细胞内的cAMP水平升高具有抑制细胞生长、促进分化及向恶性转化的作用，环磷酰胺的所致的免疫抑制与淋巴细胞内的cAMP含量相关[4]。运晨霞等[14]报道，芒果苷具有联合CTX抗肿瘤作用，可拮抗CTX对荷瘤小鼠的免疫抑制作用，降低脾T淋巴细胞内cAMP的含量；韩剑众等[15]报道，日粮中添加中草药对实验猪进行40天的饲喂实验，发现中草药能提高血浆cAMP含量及cAMP/cGMP比值，对猪的生长和抵抗力都存在影响。本研究显示，高剂量的连翘苷能拮抗环磷酰胺所致的外周血淋巴细胞cAMP含量升高，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，虽然没有恢复到正常水平，但说明连翘苷通过某种途径对细胞内信号传导进行干预，进而调节细胞功能。

4 结论

通过对小鼠免疫器官、巨噬细胞、免疫因子以及淋巴细胞内cAMP的分析，适宜剂量的连翘苷对免疫系统有较广泛的调节作用，能够拮抗环磷酰胺所致的免疫抑制，提高机体免疫力。鉴于中草药及其组分的作用机制尚未完全清楚，从细胞膜受体或相关信号转导通路方面深入研究是下一步工作重点。

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[收稿2017- 02- 23 修回2017- 04- 03]

(编辑 许四平 刘格格)

Experimental study on phillyrin resist mice immunosuppression induced by Cyclophosphamide

YU Xiao- Dong,WANG Li- Xin.

The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China

Objective:To study the effect of phillyrin on immune function in mice treated with cyclophosphamide.Methods: Mice model of immunosuppression was induced by intraperitoneal injection of cyclophosphamide,the mice in the experimental group

phillyrin with 50,100 and 150 mg/kg doses by gavage.While model group and control group received normal salin,all treatments continued 7 d.The thymus and spleen organ coefficients was measured by conventional methods.The phagocytosis of peritoneal macrophages was measured by FITC microspheres.The levels of IL- 2,IL- 4 and cAMP in peripheral blood were detected by ELISA.The effects of different doses of phillyrin on the above indexes were analyzed in immunosuppressed mice.Results: A mice model of immunosuppression was established after 7 d,the results showed that the immune organ index,phagocytic capacity of macrophages and the level of immune factors in serum could be improved,and the content of cAMP in peripheral blood lymphocytes was decreased in different degree by phillyrin.Conclusion: Phillyrin has the function of immune regulation,which can resist the immunosuppression of cyclophosphamide.

Phillyrin;Mice;Immunosuppression

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.011

①本文为辽宁省科技厅2014年自然科学基金项目(No.2014022048 )。

于晓东(1985年-)，女，硕士，主管护师，主要从事临床免疫和肿瘤的诊断、治疗和教学工作，E- mail：106821318@qq.com。

及指导教师：王立辛(1977年-)，女，硕士，副教授，主要从事动物遗传学、动物免疫学研究和教学工作，E- mail：wanglixin417@163.com。

R332 R282.71

A

1000- 484X(2017)08- 1177- 04

②锦州医科大学畜牧兽医学院，锦州 121001。