mt01对人牙周膜细胞中成骨细胞相关因子mRNA表达的影响

张松涛，赵西珍，高 黎

(1.三门峡口腔医院，河南 三门峡472000；2.三门峡市中心医院口腔科，河南 三门峡472000；3.郑州大学口腔医学院 儿童口腔科，河南郑州450052)

*通讯作者

mt01对人牙周膜细胞中成骨细胞相关因子mRNA表达的影响

张松涛1，赵西珍2，高 黎3*

(1.三门峡口腔医院，河南 三门峡472000；2.三门峡市中心医院口腔科，河南 三门峡472000；3.郑州大学口腔医学院 儿童口腔科，河南郑州450052)

临床上很多牙病治疗需要借助牙齿的再生功能才能达到治疗的目的，如口腔正畸，通过外力将牙齿移动位置后原有的牙齿发生了位移，其原有的牙骨受到破坏，需要在新位置上的牙周膜细胞重新生成牙骨，通过这种破骨-成骨过程达到实现骨改建的目的[1,2]。在此过程中，牙周膜细胞中成骨分化是实现牙槽骨改建最重要的步骤[3,4]。临床上很多患者不具备较强的牙周膜细胞成骨分化能力，使正畸的效果受到影响，或者临床为了加快正畸完成时间，需要通过一定的手段促进牙周膜细胞成骨分化速度。目前，正畸成为大部分家庭儿童或成年人的牙保健选择，因此，需要正畸的人群数量庞大，而大多数正畸完成的时间在1.5-2年，对患者的工作、学习造成严重影响[5,6]。因此，寻找可以促进牙周膜细胞成骨分化的方案已成为临床研究的热点。基于此，在充分研究目前促进牙周膜细胞成骨分化临床文献的基础上，我们选择寡核苷酸mt01作为促进人牙周膜细胞成骨分化的切入点，分析不同浓度的寡核苷酸mt01对人牙周膜细胞成骨分化的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2015年1月-2016年1月在三门峡口腔医院行牙齿正畸时拔除的健康牙齿作为研究对象。

1.2 仪器与试剂

ODN mt01(大 连 宝 生 物 公 司)；CO2恒温培养箱(美国NAPCO公司生产)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司生产)胰蛋白酶(美国Sigma公司生产)；磷酸盐缓冲液(自制)；超净工作台(苏州净化有限公司生产)；恒温水浴箱(常州实验仪器有限公司生产)；离心机(常州实验仪器有限公司生产)；原位杂交仪(杭州瑞成仪器有限公司生产，型号：SH2000)，4块板加热振荡器(杭州瑞成仪器有限公司生产，型号：TS300)。寡核苷酸探针：安必奇生物科技有限提供。

1.3 方法

按照人牙周膜细胞离体培养、寡核苷酸混合培养和原位杂交技术测定的步骤完成实验过程。具体方法如下。

1.3.1 人牙周膜细胞离体培养 刮取健康牙齿牙周膜进行双抗处理，置于消化液中，于4℃冰箱中消化处理16 h，显微镜下夹取分离上层表层细胞，置于胰蛋白酶中，于37℃恒温水浴箱中消化15 min，然后吹打呈单细胞悬液，离心加入培养液，调整细胞浓度越为500×103个/ml，接种培养值细胞张曼培养皿，进行后续传代培养，连续培养三代。收集第三代培养细胞备用。

1.3.2 寡核苷酸mt01+人牙周膜细胞混合培养 取生长良好的三代人牙周膜细胞，按照每孔铺5×103个细胞分别接种于96孔板中的50个样品孔中进行培养，待细胞贴壁后，分别向孔内加入不同浓度(1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L)的寡核苷酸mt01溶液和对照PBS各10份，继续培养96 h。采用原位杂交技术检查添加不同浓度寡核苷酸mt01的人牙周膜细胞中ALP、BGPmRNA表达结果差异，以细胞染色程度判定ALP和OCNmRNA阳性表达率。

1.3.3 原位杂交技术测定人牙周膜细胞中ALP、OCNmRNA表达 将商购的寡核苷酸探针采用3’-尾端标记法行DIG标记寡核苷酸探针。采用磷酸缓冲液(PBS)对培养得到的人牙周膜细胞逐份洗涤3次，分别采用稀盐酸溶液室温处理10 min，再经PBS洗涤3次，向细胞悬液中滴加蛋白酶K溶液，于37℃水域中培养8 min，加入PBS洗涤、过滤3次，经洗涤的细胞采用多聚甲醛处理固定，室温放置10 min后，PBS洗涤2次，加入乙醇脱水15 s；向每管细胞悬液中加入杂交液(配制方法:HybA液18 μl，HybB液2 μl，混合后，80C加热10 min，离心15 s),加塞密封，置于42C摄氏度水浴箱中保温20 h，去掉管塞，向试管里加入甲酰胺×SSC，于37℃水浴箱中洗涤30 min，2×SSC，于37℃水浴箱中洗涤15 min 0.1×SSC，37℃水浴箱中洗涤5 s，BufferI洗5 s×1次；加入马血清封闭页面，室温放置50 min，向试管内加入抗Dig-AP50 μl，37℃水浴箱中放置60 min；Buffer溶液洗涤3次，每次15 min，Buffer溶液洗涤3次，每次洗涤1 min；加入NBT/BCIP显色/核固红复染。放置5 min后，取溶液于显微镜下观察细胞浆内颜色变化。

1.4 结果判定

ALPmRNA阳性表达判定：在细胞胞浆内若有弥散分布的细纱样的蓝紫色点状颗粒，判定为+；颗粒染色加深，颗粒变大，记录为++；+和++样品份数之和/总份数×100%，为ALP阳性表达率。

OCN mRNA阳性表达判定：细胞内出现细小的蓝紫色颗粒，表明有OCN的转录表达，记录为+；颗粒变大，颜色加深，判定为++；阳性率计算同ALPmRNA表达阳性率。

1.5 统计学处理

对研究所得数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料行t检验，计数资料行卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度寡核苷酸mt01对人牙周膜细胞ALPmRNA表达比较

不同浓度寡核苷酸mt01培养人牙周膜细胞中ALPmRNA表达阳性率均明显高于PBS对照组，差异有统计学意义(P<0.05),2 mg/L浓度寡核苷酸mt01培养人牙周膜细胞中ALPmRNA表达阳性率明显高于浓度1 mg/L、3 mg/L、4 mg/L浓度寡核苷酸mt01，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度寡核苷酸mt01对人牙周膜细胞ALPmRNA表达比较

注：*与对照组比较，P<0.05，#与2 mg/L比较，P<0.05。

2.2 不同浓度寡核苷酸mt01对人牙周膜细胞OCN mRNA表达比较

不同浓度寡核苷酸mt01培养人牙周膜细胞中OCNmRNA表达阳性率均明显高于PBS对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；2 mg/L浓度寡核苷酸mt01培养人牙周膜细胞中OCNmRNA表达阳性率明显高于浓度1mg/L、3 mg/L、4 mg/L浓度寡核苷酸mt01，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度寡核苷酸mt01对人牙周膜细胞OCN mRNA表达比较

注：*与对照组比较，P<0.05，#与2 mg/L比较，P<0.05。

3 讨论

近年关于骨的新陈代谢研究发现，骨是一种新型的内分泌器官，骨在合成过程中分泌两种激素，即成纤维细胞因子23 和骨钙素 (OCN)[7,8]。这两种激素对体内磷和能代谢具有较强的调节作用，在骨的生长代谢中发挥重要作用。其中成骨细胞产生的OCN释放到血液中后，分布到全身多种器官和组织，发挥对胰岛素β细胞、脂肪细胞等的调节作用，而胰岛素β细胞和脂肪细胞反馈至骨，则促进骨钙素的活化，增强了骨的新成代谢，促进骨的重建[9,10]。骨细胞和成骨细胞是产生OCN的主要部位，以羧化无活性形式储存于骨胞外基质中，破骨细胞在骨表面产生的酸度适宜时，OCN 脱羧化成为uc OCN 活性形式，促进β胰岛细胞分泌胰岛素。因此，骨钙素能反映相关器官、组织及细胞的骨重建的过程[11,12]。

碱性磷酸酶是成骨细胞分泌的胞外酶，其在骨组织形成、代谢、再生过程中发挥重要作用，是临床判断成骨细胞分化情况的重要标志物。目前ALP 被临床普遍认可为细胞成骨向分化的灵敏标志物，是评价细胞成骨向分化可靠指标。

临床实验室研究显示，特定序列的寡核苷酸对成骨-破骨平衡系统具有调节作用[13,14]。目前筛选出的对大鼠骨髓间充质干细胞和人源性成骨样细胞系MG63细胞生物学特性有影响作用的特定序列寡核苷酸mt01。人牙周膜是具有多向分化潜能的细胞，在牙齿的重建过程中发挥重要作用[15]。

基于上述研究，本研究通过寡核苷酸mt01作用于人牙周膜细胞后，对其骨钙素和碱性磷酸酶mRNA表达情况进行分析，以明确寡核苷酸mt01是否能促进人牙周膜细胞成骨分化作用。结果显示，经寡核苷酸mt01作用后的人牙周膜细胞中ALPmRNA表达阳性率、OCNmRNA表达阳性率均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明寡核苷酸mt01具有促进人牙周膜细胞中成骨细胞相关因子mRNA表达的作用，其中以浓度水平为2 mg/L的寡核苷酸mt01促进ALP和OCNmRNA的阳性率效果最好。这为临床牙重建相关的治疗过程促进牙骨重建药物制剂研究提供了新的方向，有望提高牙重建相关治疗的质量和水平。

综上所述，寡核苷酸mt01可促进人牙周膜细胞中成骨细胞相关因子ALP和OCNmRNA表达，因此寡核苷酸类制剂具有促进人牙周细胞成骨向的作用，可作为人牙相关疾病治疗的辅助药物，促进人牙周成骨分化，降低人牙周膜细胞成骨分化的时间，提高治疗质量，提高正畸等牙病治疗的适应症，具有较高的临床价值。

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1007-4287(2017)08-1430-03

2016-07-23)