组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对卵巢癌SKOV3细胞增殖凋亡的影响

黄玉琴

(湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院， 湖北 襄阳441000)

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对卵巢癌SKOV3细胞增殖凋亡的影响

黄玉琴

(湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院， 湖北 襄阳441000)

目的 探讨MS-275对卵巢癌SKOV3细胞增殖凋亡的影响及其作用机制。方法 MTT法检测MS-275和顺铂单药及联合用药对SKOV3细胞增殖的影响，并计算半抑制浓度IC50；流式细胞术检测MS-275和顺铂单药及联合用药对SKOV3细胞凋亡的影响；Western-Blot法检测各组BCL2、survivin及p21蛋白的表达。结果 MS-275和顺铂两单药均可抑制SKOV3的增殖，各浓度组具有统计学差异(P<0.05),联合用药时可显著降低顺铂半抑制浓度(P<0.05)；同时两单药组可促进SKOV3细胞凋亡(P<0.05)，联合用药时凋亡作用更显著(P<0.05)；MS-275和顺铂可显著抑制SKOV3细胞BCL-2和survivin蛋白的表达，增强p21的表达(P<0.05)。结论 MS-275抗SKOV3细胞增殖，促进其凋亡及增强顺铂敏感性的机制可能与抑制HDAC活性，抑制BCL-2和survivin蛋白表达，促进p21蛋白表达有关。

MS-275；顺铂；卵巢癌；SKOV3

(ChinJLabDiagn,2017,21:1448)

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)主要通过调节组蛋白的乙酰化状态从而调控染色质的结构和基因的表达。组蛋白的乙酰化状态由两个酶家族调节：组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HADCs)。HDACs家族分为18种不同亚型；Ⅰ类(HDAC1-3和8)、Ⅱ a类(HDAC4、5、7和9)、Ⅱ b类(HDAC6和10)、Ⅲ类(SIRT1-7)和Ⅳ(HDAC11)[1]。而HDAC抑制剂(HDACIs)可分为5类，包括短链脂肪酸、羟肟酸、环状四肽、脂族酸和苯甲酰胺。其中MS-275是一种苯甲酰胺类HDAC抑制剂。在多种肿瘤实验中，表现出良好的抗肿瘤活性，包括胰腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]及黑色素瘤[5]等实体肿瘤。本研究主要以卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，探讨MS-275对卵巢癌SKOV3细胞增殖凋亡及化疗敏感性的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料

SKOV3细胞株购自武汉大学细胞典藏中心，注射用顺铂(冻干型)购自齐鲁制药有限公司，MS-275购自美国Cayman公司，McCoy's 5A液体培养基购自武汉博士德生物工程有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，MTT 试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗人BCL-2、survivin及p21抗体购自美国Santa公司。

1.2 细胞培养

SKOV3细胞于McCoy's 5A液体培养基(10%胎牛血清)在37℃5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，待细胞长至80%左右时，0.25%胰酶(含EDTA)消化传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖

收集生长对数期细胞，调整细胞密度为1×104/ml， 100 μl/孔接种于96孔板中，PBS填充边缘孔，置于细胞培养箱继续培养。细胞贴壁处于生长对数期时，MS-275(2、4、6、8、10 μmol/L)，DDP(2.5、5、10、20和40 μg/ml)，联合用药组为MS-275 (5 μmol/L)联合DDP(2.5、5、10、20和40 μg/ml)浓度梯度处理各组细胞，设置3复孔，同时设置调零孔、对照孔，继续培养48 h。每孔加入20 μl MTT染色液，继续培养4 h，后每孔加入150 μl Formanzan溶解液，酶联免疫检测仪测定570nm下各孔吸光度，细胞抑制率%=1-(OD加药孔-OD调零孔)/(OD对照孔-OD调零孔)。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

药物处理后，收集细胞培养液于15 ml离心管内，2 ml PBS清洗，每孔加入0.25%胰酶400 μl，于培养箱消化约1 min，后将前述收集的细胞培养液加入6孔板终止消化，小心吹散细胞，收集细胞液于15 ml离心管内，2 000 rpm离心3 min，弃上清，1 ml PBS重悬细胞并转移至1.5 mlEP管内，2 000 rpm离心3 min，弃上清，每管加入Annexin V-FITC结合液150 μl，Annexin V-FITC 5 μl，碘化丙啶染色液5 μl，避光室温孵育20 min，随即进行流式细胞仪检测。

1.5 Western-Blot检测蛋白表达

各组药物处理后细胞，细胞裂解液冰上处理30 min，取上清液，BCA测定蛋白含量，加入上样Buffer，沸水浴5 min，SDS-PAGE凝胶电泳，分离后蛋白电泳转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗(兔抗人BCL-2、survivin和p21多克隆抗体)在4℃条件下过夜12 h，分别加入HRP标记羊抗兔抗体作用1 h，TBST洗膜3次， ECL显影。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1MS-275对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

MTT实验结果表明，不同浓度MS-275及顺铂单药处理SKOV3细胞48h后均能抑制细胞生长增殖(见表1)，其中MS-275单药组IC50为5.98±2.19μmol/L，顺铂单药组IC50为11.39±3.04μg/ml。因此，联合用药组时MS-275固定浓度为5μmol/L，联合用药组与顺铂单药组比较各浓度间具有统计学差异(P<0.05)(见表2)，同时联合用药组时顺铂IC50为5.60±2.35μg/ml，顺铂单药组IC50与联合用药组顺铂IC50比较，两者具有统计学意义(t=5.876，P<0.05)，结果显示，MS-275可显著抑制SKOV3细胞生长，增强SKOV3对顺铂的敏感性，降低顺铂的半抑制浓度。

表1 不同浓度MS-275和顺铂对SKOV3细胞的抑制率

表2 MS-275联合顺铂对SKOV3细胞的抑制率

2.2 MS-275对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

依据MTT实验结果，取MS-275浓度5 μmol/L，顺铂浓度10 μg/ml作用SKOV3细胞48 h后检测各组细胞凋亡情况，结果表明，与对照组相比，两单药组及联合用药组细胞凋亡率比较差异具有统计学意义(P<0.05)，两单药组无明显统计学差异(P>0.05)，而联合用药组与两单药组细胞凋亡率相比差异具有统计学意义(P<0.05)(如图1)。

图1 MS-275对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

2.3 MS-275对SKOV3细胞BCL-2、survivin和p21表达的影响

Western结果显示，MS-275可显著增加SKO3细胞中p21蛋白的表达，降低survivin和bcl-2蛋白的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，当与顺铂联用时，p21蛋白表达更高，与两单药组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，survivin和bcl-2表达水平显著降低，与两单药组比较差异具有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

图2 MS-275对SKOV3细胞BCL-2、survivin和p21表达的影响

3 讨论

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，多数患者就诊已属晚期，手术治疗和化疗治疗效果差，远期存活率低。近年来对卵巢癌的表观遗传学研究为卵巢癌的治疗提供了一种新思路。卵巢癌恶性进展的分子基础包括遗传和表观遗传学的改变，而基因的表达由表观遗传学控制，如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等[6]。其中，组蛋白修饰是通过影响组蛋白之间的功能作用或组蛋白与DNA的连接而改变染色质的结构。组蛋白的乙酰化状态由两个酶家族调节;它们是组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)。HDAC家族分为四类：Ⅰ类(HDAC1-3和8)，Ⅱa类(HDAC4,5,7和9)，Ⅱb类(HDAC6和10)，Ⅲ类[sirtuins，(SIRT1-7)]和Ⅳ类(HDAC11)。近年来研究表明，赖氨酸残基的乙酰化状态失衡与肿瘤的发生发展密切相关。基因的突变、过表达或易位改变均可影响HAT和HDAC活性，从而使组蛋白乙酰化状态失衡，促进肿瘤的发生和发展。BCL-2基因的异常活化参与恶性肿瘤的增殖和凋亡，通常认为，顺铂主要引起癌细胞DNA损伤，导致细胞周期停滞，从而诱导细胞凋亡，而研究表明，BCL-2在卵巢癌对顺铂的耐药性方面发挥了重要作用[7]。Survivin是凋亡家族成员，影响多种细胞功能，包括细胞存活、增殖和侵袭等，在大多数正常组织中，survivin表达极低，而在肿瘤组织中高表达，包括卵巢癌[8]。Survivin的高表达与肿瘤的恶性增殖、低凋亡、化疗耐药、转移、肿瘤复发和不良预后密切相关[9，10]。p21是一种细胞周期负性调节因子，通过抑制Cyclin E-CDK2和Cyclin D1-CDK4的激活，从而使细胞周期停滞在G1期，此外，通过调控细胞周期参与肿瘤细胞的凋亡[11]。

本文研究了MS-275单药或联合顺铂作用于卵巢癌SKOV3细胞，结果显示，一定条件下，MS-275可显著抑制SKOV3细胞活性，而与顺铂联用时可增强顺铂敏感性，对细胞活性抑制作用更显著。细胞凋亡实验结果亦显示，MS-275可诱导SKOV3细胞凋亡。此外，本文还检测了SKOV3细胞中BCL-2、Survivin和p21蛋白表达情况，Western-Blot结果显示，MS-275可抑制BCL-2和Survivin蛋白的表达，增加p21的表达水平。由此说明，MS-275抗SKOV3细胞增殖，促进其凋亡及增强顺铂敏感性的机制可能与抑制HDAC活性，抑制BCL-2和survivin蛋白表达，促进p21蛋白表达有关。

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Effect of histone deacetylase inhibitor MS-275 on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV3

HUANGYu-qin.

(XiangYangNo.1Pelople’sHospital,HubeiUniversityofMedicine，Xiangyang441000，China)

Objective To investigate the effect of MS-275 on the proliferation and apoptosis and its mechanism of SKOV3 cells.Methods The proliferation inhibitory rates of SKOV3 cells treated with MS-275 or DDP alone and the combination of MS-275 and DDP were detected by MTT assay，and calculate the half inhibitory concentration (IC50).The apoptosis rate of SKOV3 cells treated with MS-275 or DDP alone and the combination of MS-275 and DDP were determined by flow cytometry.The expression levels of BCL-2、survivin and p21 proteins in SKOV3 cells were examined by Western-Blotting.Results MS-275 and cisplatin alone could inhibit the proliferation of SKOV3,each concentration group has significant difference(P<0.05),United can significantly reduce the half inhibitory concentration of cisplatin(P<0.05).MS-275 or DDP alone can promote apoptosis of SKOV3 cell(P<0.05),MS-275 and cisplatin significantly inhibited the expression of BCL-2 and surviving,and enhanced the expression of p21 in SKOV3 cells (P<0.05).Conclusion The mechanism of MS-275 anti-SKOV3 cell proliferation,promoting apoptosis and enhancing cisplatin sensitivity may be related to inhibition of HDAC activity,inhibition of BCL-2 and survivin protein expression,and promotion of p21 protein expression.

MS-275;cisplatin;ovarian cancer;SKOV3

1007-4287(2017)08-1448-04

R737.31

A

2016-07-28)