电针对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及LC3Ⅱ、P62表达水平的影响

高 杨，李丽娜，毛颖秋，周英奕，张学婷，张 磊，薛卫国

（北京中医药大学，北京100029）

电针对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及LC3Ⅱ、P62表达水平的影响

高 杨，李丽娜，毛颖秋，周英奕，张学婷，张 磊，薛卫国*

（北京中医药大学，北京100029）

目的 研究电针对APP/PS1双转基因小鼠自噬相关蛋白LC3Ⅱ及受体蛋白P62相关的作用机制。方法 将7月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、电针治疗组，以同窝转基因阴性小鼠为正常对照组。电针治疗组予电针涌泉、百会，15 min／次，隔日1次，治疗6周，利用Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力以及用Western blot法检测小鼠海马区域LC3Ⅱ及P62蛋白的表达。结果 水迷宫结果显示,模型组与正常对照组比较，逃避潜伏时增加（P＜0.01）；WB结果显示，与对照组相比，模型组LC3Ⅱ表达增强，P62表达减弱（P＜0.05）；与模型组相比，针刺组LC3Ⅱ表达减弱，P62表达增强（P＜0.05）。结论 APP/PS1转基因鼠存在神经元自噬途径功能亢进，电针可能通过抑制自噬水平，从而改善学习记忆功能。

阿尔茨海默病；APP/PS1；LC3Ⅱ；P62

阿尔茨海默病（AD），又称老年性痴呆，是一种病因不明的中枢神经系统进行性变性疾病，临床表现为获得性认知功能障碍[1]。其主要由大量异常折叠的β淀粉样蛋白（Aβ）在脑组织中沉积所形成的老年斑引起[2]。细胞内Aβ的降解主要在溶酶体中进行[3]。AD的脑内缺陷是由自噬体逆行运输至溶酶体，从而触发营养不良和变性肿胀的轴突上大量自噬泡的聚集[4]。因此，自噬被认为是产生Aβ的一个新途径[5]。近年来，电针防治AD的疗效已得到肯定，治疗AD的机制研究也取得新进展。中医认为痴呆以“肾虚浊阻”为主要病机[6]，故治以“益肾祛浊”法[7]，电针百会、涌泉，以AD病理中期的7月龄APP/PS1小鼠为研究对象，观察研究其自噬相关蛋白LC3Ⅱ和自噬底物P62的变化以及针刺对其表达的影响，旨在揭示针刺是否通过早期干预自噬水平从而改善AD学习记忆能力，以期为针灸临床防治AD奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组

1.1.1 动物 选取健康清洁级，5月龄，雄性APP/PS1双转基因小鼠为AD动物模型14只。同窝同性别同月龄转基因阴性鼠7只为正常对照组。体质量（26.8±4.5） g，由南京大学模式动物研究所提供。本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 分组 小鼠满5月龄时称重排序，利用随机数表分组，将APP/PS1双转基因小鼠14只，分为模型组（M）7只、电针治疗组（A）7只，同窝APP/PS1双转基因阴性雄性小鼠7只为阴性对照组（W）。

1.1.3 干预方法 电针治疗组：将小鼠固定于操作台上，对照小鼠针灸穴位图谱及动物解剖学方法，取百会、涌泉穴。选用北京中研太和医药公司生产的一次性针灸针，规格0.25 mm×13 mm。针具与穴位常规消毒后刺入2～3 mm，百会穴行手针，双涌泉穴小幅度捻转后接入韩式电针仪，采用疏密波，频率1/50 Hz，强度0.5 mA，以针柄微颤，动物保持不挣扎为度。针刺持续15 min/次，隔日1次。共治疗6周。模型组、正常对照组：以相同方法用鼠袋束缚15 min，隔日1次，共束缚6周。

1.2 试剂与仪器 Ⅰ抗：兔源LC3B抗体（美国，Sigma，L7543)，兔源P62抗体（美国，Sigma，P0067），鼠源GAPDH（北京中杉金桥，TA-08）；Ⅱ抗：鼠源辣根过氧化物标记生物素（北京中杉金桥，ZB-2301），羊源辣根过氧化物标记生物素（北京中杉金桥，ZDR-5307）；BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱）；酶标仪（Biocell，中国）；电泳、电转仪（Bio-Rad，美国）；一次性使用无菌针灸针（0.25 mm×13 mm，北京中研太和医药有限公司）；韩氏（HANs）LH202H型穴位神经刺激仪（北京华卫产业开发公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠学习记忆能力检测 采用Morris水迷宫法检测各组小鼠的学习记忆能力。各组小鼠针刺6周后进行测试，水温保持在（22±2）℃，将1个隐藏的平台浸入1 cm水面之下。各组小鼠连续训练4 d，以第1、2、4象限池壁中点为出发点，将小鼠面向池壁轻放入水中，允许小鼠寻找平台的时间为最大60 s，且允许其在平台上停留30 s，记录小鼠找到平台所需要时间，即为潜伏期。

1.3.2 WB检测小鼠脑海马LC3Ⅱ与P62的表达 蛋白提取：称取海马湿重，加入RIPA裂解液（100 mg/ 1 mL）于冰上充分匀浆，4 ℃、12 000 r/min，离心15 min，然后将上清液转移到1.5 mL离心管中。

BCA法测上清液蛋白浓度，将蛋白样品和样品缓冲液以4∶1的比例混合，95 ℃恒温水浴5 min。12%的分离胶及5%浓缩胶SDS-PAGE分离胶电泳，100 V，2 h；转至0.22厚PVDF膜，100 V，60 min。用5%脱脂奶粉加入PBST配置封闭液，室温摇床封闭2 h。加入一抗，一抗用封闭液稀释（兔抗鼠LC3B，1∶2 000；兔抗鼠，1∶2 000；抗鼠GAPDH，1∶2 000），4 ℃孵育过夜。PBST漂洗3次,每次5 min。加入二抗，用PBS稀释二抗（山羊抗兔HRP-IgG，1∶2 000；山羊抗鼠HRP-IgG，1∶5 000），室温下摇床1.5 h。PBST清洗3次。将ECL发光液滴加至膜上，避光，室温孵育3 min。暗室内进行X光胶片曝光，显影、定影，灰度扫描后分析，对各组的LC3Ⅱ、P62分别与GAPDH的灰度值进行相对性比较。

1.4 统计学处理 SPSS 20.0统计软件进行分析，所有数据用均数±标准差（x±s）表示。若各组数据呈现正态分布，且方差齐，进行单因素方差分析，若方差不齐，用非参数检验。Morris水迷宫数据采用重复测量方差分析。以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

2.1.1 定位航行实验 见表1。

2.1.2 空间探索实验穿越平台次数及平台象限停留时长 见表2。

2.2 WB检测结果 见表3。

表1 定位航行实验第一象限（远离目标象限）入水点逃避潜伏期时的比较（x±s ，n=7）

表2 空间探索实验第一象限入水点穿越平台位置次数、平台象限停留时长的比较（x±s ，n=7）

表3 电针对7月龄APP/PS1鼠LC3II、P62相对表达量的影响（x±s ，n=7）

3 讨论

由Aβ聚集和沉积而成的老年斑（SP）是AD脑部典型的病理特征之一[8]，被认为是AD发病的始动因素[9]。Aβ由淀粉蛋白前体蛋白（APP）经β-分泌酶和早老素1（PS1）/ γ-分泌酶相继切割产生[10]。本实验所用小鼠同时携带“瑞典家族”突变的APPswe与PS△E9基因，随月龄增加出现认知功能的进行性损害，脑组织出现SP沉积及神经元丢失，因此，APP/PS1双转基因小鼠是研究AD病理机制及药物筛选的理想动物模型[11]。本实验模型组小鼠认知功能的退化，同时也证实了Aβ沉积在AD中扮演了极为重要的角色。

自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和错误折叠的蛋白质等有害大分子物质的重要途径[12]。然而，当自噬功能发生障碍时，自噬被过度激活，其异常活跃而亢进的功能将会反作用于AD的发病。研究发现自噬泡（包括自噬体和自噬溶酶体）中富含APP、Aβ及γ-分泌酶，自噬被过度激活可引起Aβ增多，因此自噬泡被认为是产生Aβ的温床[13]。LC3 II的水平可以反映自噬体和自噬泡的数量，因此常被用作自噬体的指示和标记物。本研究中模型鼠脑中LC3Ⅱ水平的增加是自噬被激活的有力证据。本课题组前期实验观察到APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积加重，可能系不成熟自噬泡聚集增加，Aβ降解受阻而导致Aβ的沉积增多所致[14-15]。

本研究中7月龄APP/PS1小鼠较之转基因阴性鼠LC3Ⅱ表达增高、P62降低，同期实验还证实该转基因小鼠Aβ水平增高。7月龄APP/PS1小鼠处于AD病程中期，该阶段学习记忆能力已经发生负向性改变。同时脑内产生过多的Aβ及其他有害物质，使得神经元内的自噬水平处于高度激活状态，因而LC3Ⅱ水平增加，而自噬溶酶体降解通路尚未发生故障，可见P62相应减少。因此，在AD病理中期，抑制自噬可能起到一定的保护作用，以其达到治未病的目的。

针刺百会、涌泉两穴是根据“益肾去浊，开窍醒神”为治疗AD的基本法则所制定。本研究观察了针刺对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响及自噬相关蛋白LC3Ⅱ与P62表达的变化，WB结果表明：转基因小鼠海马区中的自噬相关蛋白LC3Ⅱ升高，P62表达减少；同期ELISA实验转基因数Aβ水平高于阴性鼠。而针刺能下调LC3Ⅱ，同时增加了P62的表达，其行为学指标得以改善。表明针刺百会、涌泉“益肾祛浊”法治疗AD的生物学基础可能是通过明显下调LC3Ⅱ，诱导P62表达来平衡细胞内自噬状态，从而降低脑内有毒物质及Aβ水平，达到改善学习记忆能力，提高认知能力的效果。但针刺对自噬影响的确切机制尚需深入研究，以及对自噬相关通路还有待进一步阐明，以求其明确而更有效的作用靶点。

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Effect of electroacupunctureure intervention on learning and memory ability, LC3Ⅱ and P62 Expression level of APP/PS1 transgenic mice

GAO Yang, LI Lina, MAO Yingqiu, ZHOU Yingyi, ZHANG Xueting, ZHANG Lei, XUE Weiguo*
(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To investigate the effect of electroacupunctureure on learning and memory ability and its mechanism related to autophagic receptor P62 in APP/PS1 Transgenic mice. Methods The 7-monthold APP / PS1 transgenic mice were randomly divided into model group and EA treatment group and negative transgenic mice were selected into the nomal control group. EA was applied to“Baihui”and“Yongquan”for 15min,once every other day for 6 weeks.The learning-memory ability was detected by using Morris water maze testing, hippocampal LC3Ⅱand P62 were detected using Western blot(WB). Results Results of Morris water maze test showed that the escape latency of model group increased compared with the control group (P＜0.01), WB results showed that compared with the control group, the model group LC3Ⅱ expression enhanced, P62 expression decreased (P＜0.05); compared with the model group, EA group LC3Ⅱ expression was decreased, P62 expression increased (P＜0.05). Conclusion EA intervention can improve learning and memory abilities in APP transgenic model mice, which may contribute to its effect in inhibiting neuronal autophagy.

Alzheimer’s disease; APP/PS1; LC3Ⅱ; P62

R245.31

A

2095-6258(2017)04-0523-04

2016-9-10）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.003

国家自然科学基金资助项目（81273826）。

高 杨（1990 -），女，硕士研究生，主要从事针灸治疗脑病机理研究。

*通信作者：薛卫国，男，博士研究生导师，电话-3718809670，电子信箱-snowmanxue@126.com