CCNB2过表达对非小细胞肺癌不良预后的预测效果研究*

王杰，陈大兴，郭宁，陶立轩

（湖北省武汉市普仁医院 心胸外科，湖北 武汉 430081）

CCNB2过表达对非小细胞肺癌不良预后的预测效果研究*

王杰，陈大兴，郭宁，陶立轩

（湖北省武汉市普仁医院 心胸外科，湖北 武汉 430081）

目的探讨细胞周期蛋白B2（CCNB2）在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及对预后的影响。方法

实时荧光定量聚合酶链反应和免疫组织化学法测定CCNB2 mRNA和蛋白在NSCLC肿瘤组织及临近非肿瘤组织中的表达水平，分析其与患者临床病理特征的关系。结果肿瘤组织中CCNB2 mRNA和蛋白表达量高于非肿瘤组织（P＜0.05），且其表达水平与肿瘤分化等级、直径、淋巴结转移、远处转移及临床分期呈正相关（P＜0.05），同时CCNB2高表达是患者生存率预后不良的危险因素。结论肿瘤组织中CCNB2高表达与NSCLC不良预后密切相关。

非小细胞肺癌；细胞周期蛋白B2；生物标志物；预后

肺癌是病死率极高的一种恶性肿瘤[1-2]，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占全部肺癌的80%～85%，发病率高[3]。临床上大多数NSCLC患者确诊时已为晚期，5年生存率仅为16%[4-5]，因此成为临床面临的一个难题，也为相关预后研究提出挑战。细胞周期蛋白B2（cyclin B2，CCNB2）在不同部位和细胞周期中发挥作用[6-8]。近年来有研究提示，其在多种人类肿瘤组织和外周血中表达增高[9-13]，且与肿瘤临床分期和转移状态相关[14]。本研究就CCNB2在NSCLC组织中的表达及其与预后的关系进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年1月-2011年12月湖北省武汉市普仁医院肿瘤科收治的NSCLC患者186例，均为临床原发灶，入组前未接受任何治疗。收集同期体检健康对照组31例。将收集的NSCLC样本和邻近非肿瘤组织样本共217例石蜡包埋，液氮保存。诊断和分期标准参照美国癌症联合委员会制定的第7版肿瘤分类标准[15]；术后随访5～60个月。本研究通过本院伦理委员会审批。

1.2 核糖核酸提取与实时荧光定量聚合酶链反应

提取组织样本总RNA，使用Trizol（大连宝生生物工程公司有限公司），通过逆转录试剂盒（大连宝生生物工程公司有限公司）进行逆转录，每个样本重复3个/孔，以β-actin基因作为内参，取5μl血清与5 μl准备液（2.5%Tween 20、50 mmol/L 三羟甲氨基甲烷和1mmol乙二胺四乙酸二钠混合，加入10μl逆转录反应体系。逆转录反应体系含2 μl 10×逆转录缓冲液、0.8 μl 25×脱氧核糖核苷三磷酸混合液（100 nmol/L）、2μl 10×随机引物、1 μl Multi ScribeTMReverse Transcriptase 试剂、1 μl RNA 抑制剂和3.2μl焦碳酸二乙酯水。反应条件：25℃预变性，10 min，37℃变性 120 min，85℃退火 5 min。反应液140 000 r/min离心5 min，取上清液，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物序列见表 1。CCNB2基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法进行计算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 免疫组织化学染色

组织样本石蜡包埋后切片，分别用二甲苯和无水乙醇脱石蜡和水，在柠檬酸钠溶液煮沸10 min介导抗原复性。3%过氧化氢和1%牛血清白蛋白封闭内源性过氧化物酶活性和非特异性位点，采用1∶200稀释的CCNB2一抗（英国Abcam公司）孵育，4℃过夜。磷酸盐缓冲溶液洗涤后加入生物素标记的二抗及亲和素标记的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）复合物，每步均室温孵育 20 min，加入发光液后显色。染色结果由2位病理学家参照相关标准观察判断[9]，总分0～7分，0～5分判为低表达，6和7分为高表达。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，计数资料以率（%）表示，用χ2检验，Kaplan-Meier法制作生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，影响因素的分析用Cox比例风险模型，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织样本中CCNB2的表达

20对NSCLC及邻近非肿瘤组织CCNB2 mRNA表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（t=45.961，P=0.001），NSCLC 样本中 CCNB2 mRNA 表达量为邻近非肿瘤组织的3.02倍（见图1）。186例石蜡包埋NSCLC样本中62.4%（116/186）为CCNB2高表达，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=12.089，P=0.001），CCNB2高表达率在NSCLC样本中高于正常组（见图 2）。

2.2 不同特征CCNB2高表达率的比较

不同特征CCNB2高表达率的比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=19.541，P=0.000），CCNB2高表达与肿瘤分化等级增加有关，CCNB2高表达率越低，肿瘤分化等级越高。CCNB2高表达与肿瘤大小的增加、淋巴结转移,以及远处转移和临床分期密切相关（P＜0.05），提示肿瘤越大、淋巴结转移越严重,以及出现远处转移和临床症状越严重，则肿瘤分化等级越高。CCNB2高表达与患者性别、年龄、吸烟史及病理学分化类型无关。见表2。

图1 20对NSCLC和邻近非肿瘤组织CCNB2 mRNA表达的比较

2.3 CCNB2高表达与NSCLC患者疾病预后关系

CCNB2低表达NSCLC患者疾病预后较好，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=33.251，P=0.000），CCNB2表达与NSCLC患者疾病总生存率相关（见图3）。CCNB2是NSCLC患者疾病预后不良的独立危险因素；但其与患者肿瘤临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移无关。Cox回归分析提示，CCNB2蛋白高表达是NSCLC患者疾病预后不良的危险因素（HR=2.272，P=0.001）。见表3和图3。

图2 NSCLC组织CCNB2蛋白表达 （免疫组织化学法）

表2 不同特征CCNB2高表达率的比较

表3 NSCLC患者总生存率的单一和多重变量分析

图3 CCNB2不同表达患者生存率曲线

3 讨论

细胞周期蛋白B2是B类细胞周期蛋白家族的成员，在分裂间期CCNB1会持续在细胞核和细胞质间穿梭，在分裂间期末CCNB1快速进入细胞核并与有丝分裂体结合[16-17]。与之相反，在分裂间期和有丝分裂期CCNB2会穿出细胞核，逐渐靠近高尔基体[18]。尽管两者在细胞内定位不同，但是CCNB1和CCNB2共同完成促发细胞进入G2/M期中的重要功能[19]。此外，CCNB1和CCNB2在氨基末端结构上有一定差异，其同源性为57%[20]。目前已经比较明确CCNB1在NSCLC中的作用，但关于CCNB2还在摸索中，YOSHIDA等[21]研究表明，CCNB2与肿瘤细胞分化、血管侵入、Ki-67增长指数及增殖细胞核抗原标记指数密切相关。研究提示，CCNB1过表达是NSCLC患者不良预后的独立危险因素[22-23]。然而CCNB2在NSCLC中的表达情况及作用研究尚不多。

基因芯片研究提示，胃癌患者的胃黏膜组织中CCNB2存在过表达状态[13]。此外，CCNB2是HPV16阳性宫颈癌患者表达上调的6种基因之一[24]。本研究结果提示，与非肿瘤肺脏组织相比，NSCLC样本中CCNB2 mRNA和蛋白高表达。进一步研究CCNB2在NSCLC组织中表达的临床意义，本研究发现CCNB2表达与NSCLC患者肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移及临床分期呈正相关。本研究结果证实，CCNB2过表达可以通过促进肿瘤细胞生长和加速肿瘤细胞转移，导致NSCLC肿瘤发展。与TAKASHIMA等[25]报道的结果近似。

国内外不少研究均提示，在多种人类肿瘤组织中检测到CCNB2过表达，且与疾病预后不良密切相关。SHUBBAR等[10]研究发现，CCNB2过表达与乳腺癌患者DSS预后有关，是其独立预后标志物。此外，TAKASHIMA等[25]也报道，肺腺癌患者肿瘤组织中CCNB2 mRNA过表达，且其表达与疾病总生存率密切相关。为进一步探讨CCNB2表达在NSCLC中的预后价值，本研究探讨CCNB2表达与患者总生存率的关系，结果证实两者呈负相关，多重变量分析提示，CCNB2过表达是NSCLC患者疾病预后不良的独立标志物。总之，NSCLC组织中CCNB2蛋白表达升高，且与肿瘤的临床分期和预后不良密切相关。

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（童颖丹 编辑）

Cyclin B2 overexpression is a poor prognostic biomarker in NSCLC patients*

Jie Wang,Da-xing Chen,Ning Guo,Li-xuan Tao
(Department of Cardiothoracic Surgery,Wuhan Puren Hospital,Wuhan,Hubei 430081,China)

ObjectiveTo identify the role of cyclin B2 (CCNB2)in patients with NSCLC.MethodsCCNB2 mRNA and protein expressions were detected in NSCLC and paracancerous tissues.Immunohistochemistry was used to detect the expression of CCNB2 protein in 186 NSCLC patients.The relationships between the expression of CCNB2 and clinicopathological features were analyzed.ResultsIn this study,the expressions of CCNB2 mRNA and protein in the tumor tissues were higher than those in the nontumor tissues(P＜0.05).The expression levels of CCNB2 mRNA and protein were positively correlated with tumor differentiation grade,tumor diameter,lymph node metastasis,distant metastasis and clinical stage (P＜0.05),while CCNB2 overexpression was a risk factor for low survival rate and poor prognosis of the patients.ConclusionsThe overexpression of CCNB2 in NSCLC is closely related to disease progression and poor prognosis,and CCNB2 could be severed as a marker of prognosis in patients with NSCLC.

CCNB2;NSCLC;biomarker;prognosis

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.009

1005-8982（2017）17-0045-05

2016-05-06

湖北省武汉市科技基金（No：WX12D26）