雷公藤甲素对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制研究

刘帮慧，张瑛

（湖北省荆州市中心医院 神经内科，湖北 荆州 434020）

雷公藤甲素对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制研究

刘帮慧，张瑛

（湖北省荆州市中心医院 神经内科，湖北 荆州 434020）

目的探讨雷公藤甲素对β-淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法通过噻唑蓝（MTT）法确立Aβ25-35诱导PC12细胞损伤模型的工作浓度；同时利用MTT法检测1×10-11、1×10-10和1×10-9mol/L雷公藤甲素对细胞活性的影响，以及雷公藤甲素和Aβ25-35同时处理细胞后对细胞活性的影响。PC12细胞随机分为3组：对照组、Aβ25-35处理组、Aβ25-35和雷公藤甲素处理组。细胞处理24h后，利用免疫荧光法检测细胞中活化Caspase-3的表达，同时采用逆转录聚合酶链反应检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达水平。结果Aβ25-35在10 μmol/L工作浓度下可诱导PC12细胞复制阿尔茨海默病体外细胞损伤模型，其细胞存活率为（58±6）%；单纯雷公藤甲素在1×10-11、1×10-10和1×10-9mol/L浓度下处理细胞对细胞活性无显著影响。Aβ25-35处理细胞后，细胞活性降低，活化Caspase-3在细胞中表达升高，同时Bax mRNA表达升高，而Bcl-2 mRNA的表达下降。然而，雷公藤甲素和Aβ25-35同时处理细胞时，前者能够降低Aβ25-35对PC12细胞的毒性损伤，且细胞活性随雷公藤甲素浓度的增加而升高；同时活化Caspase-3在细胞中的表达，Bcl-2和Bax mRNA表达水平也受抑制。结论雷公藤甲素可能通过调节Caspase-3、Bax及Bcl-2基因的表达以抑制细胞凋亡，从而对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤发挥保护作用。

雷公藤甲素；阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白；细胞凋亡。

阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）是多发于中老年的中枢神经系统退行性疾病，以渐进性记忆减退、认知障碍及人格改变为主要临床特征[1]。病理特征为全脑萎缩、脑细胞外出现大量淀粉样蛋白沉积而形成的老年斑、神经元纤维缠结、神经元颗粒空泡变形及丧失[2]。

雷公藤甲素是具有多种生物活性的天然产物，具有抗炎、抗氧化、抗类风湿及神经保护等功效[3-5]。本实验用Aβ25-35复制PC12细胞损伤模型，研究雷公藤甲素对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 PC12细胞系（大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系）购自上海细胞生物学研究所。

1.1.2 试剂及器材 Aβ25-35、雷公藤甲素、噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra zolium bromide，MTT]、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、4'，6- 二脒基 -2- 苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）均购自美国Sigma公司，无血清细胞冷冻保存培养基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素-链霉素等均购自美国Gibco公司，单克隆兔抗活化Caspase-3抗体购自英国Abcam公司，山羊抗兔荧光二抗购自美国Life Technologies公司，核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取试剂盒、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 试剂盒均购自大连宝生生物技术有限公司，Bcl-2、Bax及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物均由北京奥科鼎盛生物公司合成，酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞培养 PC12细胞用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基培养，更换培养液1次/2 d，待细胞密度达80%时，用0.05%胰蛋白酶消化细胞，加含血清培养液终止反应并传代。

1.2.2 MTT法检测细胞活力 PC12细胞接种于96孔板，24 h后进行相应处理，处理完成后，移去培养液，加入0.5 mg/ml MTT 37℃孵育4 h。弃去MTT后加入150 μl DMSO，避光条件下培养板剧烈摇晃10 min，并利用酶标仪测试570 nm处溶液的吸光值，每组实验重复≥3次并收集数据，取平均值为最终数值，设定对照组吸光值为100%，其余组别以该组吸光值与对照组吸光值的百分比来表示，所有数据导入Graphpad Prism数据分析软件进行分析，记录统计结果。

1.2.3 细胞免疫荧光检测 PC12细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，培养24h后，细胞随机分为3组：对照组、Aβ25-35处理组、Aβ25-35和雷公藤甲素处理组。继续培养24h后，弃去培养液，PBS漂洗3遍，加入4%预冷多聚甲醛固定细胞15 min，PBS漂洗3遍，加入0.1%Tition X-100打孔10 min，PBS漂洗3遍，加入含1%牛血清白蛋白的细胞封闭液封闭1 h，加入含有活化Caspase-3单克隆抗体（1∶200稀释）的封闭液4℃孵育过夜，PBS漂洗3遍，加入山羊抗兔荧光二抗（1∶100）室温避光孵育1 h，PBS漂洗3遍，DAPI进行细胞核染色，PBS漂洗3遍，细胞封片并在倒置荧光显微镜下观察细胞染色结果。

1.2.4 RT-PCR反应 PC12细胞铺于6孔板中，37℃培养箱中过夜培养，将细胞随机分成3组：对照组、Aβ25-35处理组、Aβ25-35及雷公藤甲素处理组。24h后，移去培养液，加入Trizol裂解液，4℃、12 000 r/min离心10 min。将上清移入1.5 ml离心管中，加入裂解液0.2倍的氯仿溶液，剧烈震荡15s，静置3min，4℃、12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清至1.5 ml离心管中，加入等体积70%乙醇，混匀，将其加入试剂盒套管中，12 000 r/min离心1 min。弃掉离心后溶液，加入蛋白液12 000 r/min离心1 min，漂洗2次。加入洗脱液洗脱RNA；使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。将得到cDNA进行RT-PCR反应，分别以Bcl-2和Bax为引物，以大鼠GAPDH作为内参，反应体系为20 μl。见附表。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件和GraphpadPrism分析软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，两两比较用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

附表 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1 Aβ25-35对PC12细胞活性的影响

PC12 细胞在 1、5、10 和 20μmol/L Aβ25-35处理下的细胞活性比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=56.440，P=0.000）。PC12细胞在不同浓度Aβ25-35处理24 h后，其细胞活性随Aβ25-35浓度升高而下降。其中，细胞在10μmol/L Aβ25-35处理24 h后细胞活性为（58±6）%，与对照组比较，经Dunnett-t检验，差异有统计学意义（t=5.44，P=0.01），该条件被应用于后续的实验中。见图1。

2.2 雷公藤甲素对PC12细胞活性的影响

PC12细胞分别在1×10-11、1×10-10和1×10-9mol/L雷公藤甲素处理24 h后，MTT检测结果显示，各组细胞活性比较，差异无统计学意义（F=1.352，P=0.219），说明雷公藤甲素在3种浓度下对PC12细胞没有毒性。见图2A。

PC12 细胞在 1×10-11、1×10-10和 1×10-9mol/L雷公藤甲素和10 μmol/L Aβ25-35处理24 h后，利用MTT法检测细胞活性，各组细胞活性比较，差异有统计学意义（F=37.017，P=0.000）。Aβ25-35处理组的细胞活性[（59.0±5.6）%]下降。而当细胞经雷公藤甲素和Aβ25-35同时处理时，其活性较Aβ25-35处理组升高。雷公藤甲素浓度为1×10-10mol/L时，细胞活性达（84.7±6.8）%，与Aβ25-35处理组比较，经 Dunnett-t检验，差异有统计学意义（t=16.245，P=0.000）。将该浓度应用于后续实验。见图2。

2.3 雷公藤甲素对活化Caspase-3表达的影响

与对照组比较，Aβ25-35处理细胞24 h后，活化Caspase-3在胞浆中表达升高。而在Aβ25-35和雷公藤甲素同时处理后，与Aβ25-35处理比较，活化Caspase-3在胞浆中表达较Aβ25-35处理组下降。见图3。

图1 不同浓度Aβ25-35处理PC12细胞24 h后的细胞活力比较

图2 雷公藤甲素对PC12细胞活性的影响

2.4 雷公藤甲素对Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

处理细胞24h后，各组细胞Bcl-2和Bax mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=29.494，P=0.000）。Aβ25-35处理组 Bcl-2和 Bax mRNA水平与对照组比较，差异有统计学意义（t=19.122 和 24，844，均P=0.000），Aβ25-35处理组的 Bcl-2表达降低，Bax表达升高。而在Aβ25-35和雷公藤甲素同时处理后，Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达水平与Aβ25-35处理组比较，差异有统计学意义（t=22.327和 29.842，均P=0.000）。Aβ25-35和雷公藤甲素组的Bcl-2 mRNA表达升高，Bax mRNA表达降低。见图4。

图3 雷公藤甲素对活化Caspase-3表达水平的影响（细胞免疫荧光，标尺10μm）

图4 雷公藤甲素对Bcl-2和Bax mRNA表达水平的影响

3 讨论

AD又叫老年痴呆，是一种中枢神经系统变性病，其主要的病理特征是全脑萎缩，脑细胞外出现大量由淀粉样蛋白沉积而形成的老年斑，tau蛋白过度磷酸化可造成细胞内神经元缠结、神经元颗粒空泡变形及其大量丧失等病理变化。近年来，随着我国人口迅速老龄化，AD困扰着越来越多的老年人，给社会和家庭带来沉重的负担。然而，AD的病因及发病机制尚不清楚。因此，深入研究AD的发病机制和寻找有效的防治措施是基础医学和临床医学面临的紧迫课题。其中，β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）在大脑组织中的异常沉积是导致AD发病的一个重要原因。因此，如何抑制Aβ引起的细胞凋亡也是目前的研究热点[6-8]。本实验利用Aβ25-35诱导PC12细胞复制AD体外细胞损伤模型，结果显示，Aβ25-35的处理降低神经元的活性并加快细胞凋亡。

雷公藤甲素，又叫雷公藤内酯醇，是一种具有多种生物活性的天然产物，来源于中药雷公藤的根。研究表明，其具有神经营养和神经保护等功效[9-12]。因此，笔者推测雷公藤甲素能够对在Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤发挥保护作用。研究结果显示，与Aβ25-35处理组比较，雷公藤甲素提高PC12细胞活性。同时，考虑到药物安全在临床应用中的重要性，笔者也检测不同浓度（1×10-11、1×10-10和 1×10-9mol/L）雷公藤甲素对PC12细胞活性的影响，结果显示，这3种浓度的雷公藤甲素对细胞活性的影响不明显，因此证明雷公藤甲素在该浓度下对PC12细胞的安全性。

AD与凋亡有关，神经细胞的凋亡是AD发病的重要环节。在细胞凋亡过程中，Caspase-3发挥重要作用，通常以无活性的前体形式存在，一经激活，将产生Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡[13]。大量研究结果证明，Caspase-3处于该级联反应的下游，通过降解细胞内相应底物使细胞死亡[15-18]。有研究表明，在脑卒中、帕金森病及AD中均可见Caspase-3的激活，说明Caspase-3在神经退行性疾病中有重要的作用[19]。本实验通过细胞免疫荧光检测活化Caspase-3在细胞中的表达，结果显示，与对照组比较，Aβ25-35能够增加活化Caspase-3的表达，而雷公藤甲素抑制Aβ25-35所诱导的活化Caspase-3表达水平的升高。

Bcl-2基因在细胞凋亡过程中发挥十分重要的作用，在细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡，从而抑制细胞的凋亡。而与之相反，在脑缺血状态下，Bax的表达可升高而促进细胞凋亡[6，19]。Bcl-2家族分为两大类，一类是抗凋亡的，在细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡，从而抑制细胞的凋亡，Bcl-2就属于这一类；另一类是促进细胞死亡，其中包括Bax基因[20-21]。RT-PCR结果显示，Aβ25-35处理后PC12细胞Bax mRNA表达水平升高，而Bcl-2降低。雷公藤甲素抑制Aβ25-35所诱导的Bax和Bcl-2 mRNA表达。

综上所述，本研究通过Aβ25-35诱导PC12细胞制备AD体外细胞损伤模型，发现雷公藤甲素能够抑制Aβ25-35诱导的细胞活性降低，活化Caspase-3表达水平升高，以及Bax和Bcl-2 mRNA表达升高。雷公藤甲素可能通过抑制细胞凋亡通路而对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤发挥保护作用，为针对细胞凋亡的阿尔茨海默病新药研究提供线索。

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（童颖丹 编辑）

Triptolide inhibits cytotoxicity of PC12 cells induced by amyloid-β25-35via apoptosis pathway

Bang-hui Liu,Ying Zhang
(Department of Neurology,Jingzhou Central Hospital,Jingzhou,Hubei 434020,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of triptolide against amyloid β-peptide 25-35(Aβ25-35)induced injury of PC12 cells.MethodsMTT assay was conducted to determine the optimal working concentration of Aβ25-35for inducing PC12 cell injury model,and the potential protective effect of different concentrations of triptolide (1×10-11,1×10-10and 1×10-9mol/L)on the PC12 cells.PC12 cells were randomly divided into 3 groups:control group,Aβ25-35treatment group,and Aβ25-35and triptolide co-treatment group.After 24-h treatment,active caspase-3 expression was observed by cyto-immunofluorescence.Meanwhile,Bcl-2 and Bax mRNA expressions were measured by RT-PCR.ResultsThein vitroPC12 cell injury model of Alzheimer's disease could be established by Aβ25-35at a concentration of 10 μmol/L with a survival rate of(58 ± 6)%.Triptolide (1×10-11,1×10-10and 1×10-9mol/L)alone had no significant effect on cell viability.Following the Aβ25-35exposure,cell viability was significantly decreased.Furthermore,active caspase-3 protein and Bax mRNA expressions obviously increased after Aβ25-35treatment,while Bcl-2 mRNA expression decreased remarkably (P＜0.05).Triptolide,however,could significantly increase cell viability in a dosedependent manner when it was added together with Aβ25-35.Moreover,triptolide could also significantly suppress the expressions of active caspase-3 protein,Bcl-2 and Bax mRNA induced by Aβ25-35(P＜0.05).ConclusionsTriptolide may inhibit cell apoptosis through modulation of expressions of active caspase-3,Bax and Bcl-2 to protect PC12 cells from Aβ25-35-induced cytotoxicity.

triptolide;Alzheimer's disease;amyloid β-peptide;cell apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.006

1005-8982（2017）17-0029-06

2016-09-21