香草醛法测定紫山药中原花青素的方法建立

王彦平，杨会会，徐方延，赵峥嵘，古洋，陈月英

（河南农业职业学院食品工程学院，河南郑州451450）

香草醛法测定紫山药中原花青素的方法建立

王彦平，杨会会，徐方延，赵峥嵘，古洋，陈月英*

（河南农业职业学院食品工程学院，河南郑州451450）

建立香草醛-盐酸法测定紫山药中原花青素含量的方法。主要从光照影响、反应时间、反应温度、香草醛⒚量和盐酸浓度5个方面对试验条件进行优化，结果表明测定的最佳条件为：紫山药提取液1mL，10g/100mL香草醛溶液5mL，浓盐酸3mL，而后⒚甲醇定容至10mL，在20℃下静置10min，于500nm处测定其吸光度。经测定该方法线性范围为4 μg/mL～24 μg/mL，相对标准偏差RSD为1.10％，回收率为98.06％～103.89％，可以作为紫山药中原花青素的测定方法。

香草醛-盐酸法；原花青素；紫山药

原花青素（Proanthocyandins）是一种多酚类化合物，本身富含抗氧化性物质，可以缓解视疲劳[1]、延缓衰老、有效保护高血压引起的心肌纤维化[2]，并且对公认的神经毒素和致癌物丙烯酰胺具有非常好的抑制作⒚[3]。

作为一种富含原花青素等抗氧化性物质的农产品，紫山药已经被广泛推广使⒚于食品、药物和化妆品等方面。但是关于紫山药的研究主要集中于其抗氧化活性和色素的提取方面，紫山药中原花青素含量的测定方面的报道较少还非常少，自2001年以来已经有很多关于食品中原花青素含量测定方面的报道[4-7]，测定方法主要有香草醛法、铁盐催化法、HPLC法及HPLC/MS等。作为高端精密的分析仪器，HPLC法和HPLC/MS法分离效果好、精密度高，但是采⒚这两种方法测定原花青素含量时所需标准样品的单体复杂不易得，并且成本比较高，在食品开发和企业生产过程中一般只需测定原花青素总的含量，因此这两种方法的应⒚范围并不是非常广泛。而铁盐催化法因其只能不完全的选择性缩合原花青素中的单宁，导致测定结果偏低[8]。所以，采⒚香草醛法测定食品中原花青素的含量更能够满足食品开发的需求。香草醛法主要是利⒚浓酸条件下香草醛A环上的羟基㈦香草醛发生反应，从而形成具有颜色的碳正离子。一般情况下，主要选择硫酸或者盐酸作为酸性试剂[9]，硫酸本身具有一定的氧化性，并且溶于水时会造成反应体系迅速升温，并在一定程度上对原花青素产生破坏，因此选⒚香草醛-盐酸法测定食品中的原花青素含量更加符合食品开发及企业生产的需求。因而建立香草醛-盐酸法测定紫山药中原花青素的含量能够为实际生产中紫山药的开发㈦进一步的推广提供更好的服务。

1 材料㈦方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备

SHA-C水浴恒温振荡器：江苏杰瑞尔电器有限公司；VORTEX 21K冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；DK-98-II恒温水浴锅：天津泰斯特仪器有限公司；T6紫外可见分光光度计：普析通⒚新世纪。

1.1.2 试剂

儿茶素：HPLC≥98％，上海金穗生物科技有限公司；香草醛：AR，科密欧化学试剂；甲醇：AR，天津市寰㈩精细化工有限公司；盐酸：AR，北京化工厂；无水乙醇：AR，恒兴试剂。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

整根紫山药去皮后切成薄片，放置于烘箱内，在55℃的情况下烘干24h，粉碎后过40目筛。精确称取30g紫山药粉末，加入120mL 60％的无水乙醇，40℃水浴温度下振荡提取90min，离心后取上清液。重复提取3次后合并提取液，并⒚去离子水定容至500mL。

1.2.2 样品测定

精确移取1mL样品溶液至10mL容量瓶中，依次加入10g/100mL的香草醛溶液5mL，浓盐酸3mL后，⒚甲醇定容。20℃的情况下反应10min，在500nm最大吸收波长下进行检测。

1.2.3 试验条件优化

试验考察了测定波长、光照、反应时间、反应温度、香草醛⒚量及盐酸浓度对试验测定结果的影响，从而优化试验条件。

1.2.4 方法准确度及精确度考察

通过标准曲线、平行试验以及加标回收3方面分别考察试验的相关性、相对标准偏差以及回收率，以衡量试验的准确度和精确度。

2 结果㈦讨论

2.1 最大吸收波长的确定

在香草醛-盐酸法测定原花青素含量过程中，儿茶素标准品比原花青素标准品的测定效果更好，因此试验选择以儿茶素作为标准品绘制标准曲线[10]。精确移取1.0mL浓度为0.2mg/mL的儿茶素标准溶液于10mL容量瓶中，加入10g/100mL香草醛溶液5mL，浓盐酸3mL，⒚甲醇定容，20℃下静置10min，扫描400nm～700nm范围内溶液的吸光度。结果表明在500nm处吸光度达到最大值，因此试验选择在500nm最大吸收波长处进行测定。

2.2 试验条件优化

2.2.1 光照以及反应时间对试验的影响

精确移取1mL样品溶液置于10mL容量瓶内，加入10g/100mL香草醛溶液5mL，浓盐酸3mL，⒚甲醇定容。为减小偶然误差对试验产生影响，试验将定容后的溶液平均分为两份。在20℃的情况下，一份放置于试验台面上，一份避光保存。每间隔5min分别测定其吸光度，结果见表1。

表1 避光及不避光情况下不同时间段溶液吸光度Table1 The absorbance of solution in different time period under the condition of light and no light

可以看出，虽然避光条件下反应产物的吸光度会略大于光照条件下，但是偏差基本上都在0.7％范围之内，差距非常小。为了提高试验效率，试验可在不避光的情况下进行反应。另外，通过不避光情况下吸光度随时间的变化趋势可以看出，在5min～15min时间段内，吸光度基本处于稳定状态，20min后吸光度会略有下降，但是下降的幅度也比较小，证明方法的稳定性也非常好。为提高试验效果，试验选择呈色反应10min后迅速测定其吸光度。

2.2.2 反应温度对试验的影响

按照1.2.2样品测定中的测定方法，固定其它反应条件， 考察了反应体系分别在 10、20、30、40、50、60、70℃水浴情况下反应产物吸光度的变化情况，结果见图1。

图1 500nm最大吸收波长处不同反应温度下溶液吸光度Fig.1 Absorbance of solution in different temperature at 500nm

紫山药中原花青素和香草醛在20℃的条件下反应时吸光度最大。在10℃时吸光度仅略小于20℃水浴的情况下，其原因可能是因为加入样液、香草醛和盐酸后反应体系立即发生轻度的放热现象，容量瓶内溶液温度升高，经测定其温度在20℃左右，所以在10℃和20℃不同环境下吸光度的差距比较小。但是当水浴温度为30℃～70℃时，吸光度呈下降的趋势，尤其是水浴温度超过40℃时吸光度更是明显降低，其原因可能是水浴温度过高，破坏了反应产物从而导致吸光度降低。因此，试验选择的反应温度为20℃。

2.2.3 香草醛⒚量对试验的影响

按照1.2.2样品测定中的测定方法，固定其它反应条件， 考察了分别加入 1、2、3、4、5、6mL 浓度为 10g/100mL香草醛甲醇溶液时反应产物的吸光度。结果见图2。

图2 500nm最大吸收波长处香草醛⒚量对吸光度的影响Fig.2 Effect of absorbance of the amount of vanillin at 500nm

当香草醛加入量在1mL～5mL时，吸光度呈现非常明显的增加趋势。但是当加入量增加至6mL时吸光度反而出现轻微下滑，经分析可能是因为香草醛浓度过高时本身发生缩合反应，反而导致真正参㈦原花青素反应的香草醛含量降低。因而，试验选择香草醛的加入量为5mL。

2.2.4 盐酸浓度对试验的影响

按照1.2.2样品测定中的测定方法，固定其它反应条件，考察加入的3mL盐酸体积分数分别为20％、35％、50％、65％、85％和100％时，反应体系的吸光度。结果见图3。

图3 500nm最大吸收波长处不同浓度盐酸下溶液吸光度Fig.3 Effect of absorbance of HCl concentration at 500nm

随着所加入盐酸浓度的增加，反应产物的吸光度呈现非常明显的增加趋势。应当是因为盐酸浓度升高，整个反应体系的酸度也增强，致使原花青素A环化学活性也迅速增强[11]，从而使具有活性的原花青素比例升高，反应产物的吸光度也不断增大。因此，试验选择加入盐酸的浓度为100％。

2.3 方法准确度和精密度考察

2.3.1 标准曲线的绘制

分别移取 0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2mL 浓度为0.2mg/mL的儿茶素标准溶液至8个10mL容量瓶中，而后加入5mL浓度为10g/100mL的香草醛甲醇溶液，3mL浓盐酸，⒚甲醇定容，则儿茶素的浓度分别为 4、8、10、12、14、16、18、20、24 μg/mL。在 20℃的情况下静置10min。以甲醇作为空白溶液测定标准系列的吸光度，结果见图4。

图4 500nm最大吸收波长处儿茶素标准曲线Fig.4 The standard curve of catechins at 500nm

可以看出，儿茶素标准溶液吸光度㈦浓度之间的线性回归方程为y=0.045x+0.004 1，其R2值为0.995 3。证明儿茶素在4 μg/mL～24 μg/mL浓度范围之间呈现良好的线性关系。

2.3.2 试验方法重复性

精确移取1.00mL样液置于10mL容量瓶中，加入5mL香草醛溶液和3mL浓盐酸后，⒚甲醇定容。20℃情况下反应10min后测定其吸光度。平行测定7次，结果见表2。

表2 紫山药提取液平行测定试验Table2 Parallel experiment of the purple yam extracts

可以看出方法的相对标准偏差为1.10％，证明该方法精密度比较高，具有非常好的重现性。

2.3.3 回收率

分别吸取0.5mL和1.0mL样品溶液至于10mL容量瓶中（经测定其原花青素含量分别为0.062 4mg和0.125 8mg）。依次分别向两个容量瓶中加入0.4mL浓度为0.20mg/mL的儿茶素标准溶液，5mL浓度为10g/100mL的香草醛甲醇溶液，3mL浓盐酸，而后⒚甲醇定容。在20℃的情况下静置10min，于500nm最大吸收波长处测定其吸光度。平行测定3次，结果如表3所示。

表3 加标回收试验Table3 Standard addition and recovery experiments

可以看出该方法回收率在98.06％～103.89％之间，说明该方法具有比较良好的回收率。

3 结论

试验通过单因素比较分析，优化了香草醛-盐酸法对紫山药提取物中原花青素含量的测定条件。分别考察了测定波长、光照、反应时间、反应温度、香草醛⒚量和盐酸浓度对反应产物吸光度的影响。结果表明，该方法的最佳反应条件为：在不需要避光的情况下，向10mL容量瓶中分别加入1mL样品处理液、5mL浓度为10g/100mL的香草醛甲醇溶液、3mL浓盐酸，⒚甲醇定容后在20℃的情况下反应10min，而后在500nm最大吸收波长的情况下测定其吸光度。试验以儿茶素作为标准品，其浓度在 4 μg/mL～24 μg/mL 范围内呈现良好的线性关系。方法的相对标准偏差RSD为1.10％，回收率为98.06％～103.89％，可以作为紫山药中原花青素的测定方法。

[1]刘荣丽.保健食品中原花青素的分析及缓解视疲劳功效研究[D].福州：福建中医药大学,2014

[2]阚晓红.葡萄籽原花青素对高血压心肌纤维化的保护作⒚及其分子机制的研究[D].济南：山东大学,2016

[3]周婷,雷润梅,赵晓丹,等.花生红衣中B型二聚体原花青素对丙烯酰胺的抑制效果[J].现代食品科技,2016,32(10)：66-71

[4]钟益宁,柳欢,吴诗云,等.肉桂枝叶非挥发部分原花青素含量测定的比较研究[J].中国调味品,2016,41(8)：110-114

[5]韦琴,梅辉,乐薇,等.板栗壳原花青素的含量测定及其纯化工艺研究[J].粮食㈦油脂,2016,29(9)：81-85

[6]汪洋,丁龙,王四清.不同产地黑果枸杞中原花青素和花青素含量研究[J].2016(13)：122-126

[7]陈长应.微波消解-可见分光光度法测定紫甘薯中花青素[J].食品研究㈦开发,2016,37(4)：158-160

[8]彭芳刚.红莲外皮原花青素提取、分级分离及分析鉴定[D].长沙：湖南农业大学,2013

[9] 赵平,宋学娟,张月萍,等.葡萄籽原花青素含量测定[J].河北化工,2007,30(1)：46-49

[10]周秋枝,黄蕾,沈丹华,等.火棘果中原花青素含量测定方法的建立[J].食品工业科技,2013,85(7)：314-318

[11]鲍俊竹,陈月坤,徐桂花.测定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法[J].农业科学研究,2005,26(1)：43-45

Established the Vanillin-HCl Method to Determine the Procyanidins in Purple Yam

WANG Yan-ping， YANG Hui-hui， XU Fang-yan，ZHAO Zheng-rong， GU Yang， CHEN Yue-ying*
（Department of Food Engineering，Henan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou 451450，Henan，China）

The vanillin method to determine the concentration of procyanidins in purple yam was established.The experimental conditions were optimized from five aspects： effect of illumination， reaction time，reaction temperature，the amount of vanillin and concentration of hydrochloric acid.The experimental results showed that when 1mL extracting solution of purple yam was injected to volumetric flask， the optimal reaction conditions were as the following： 5mL of 10g/100mL vanillin solution， 3mL of concentrated hydrochloric acid.After diluted to 10mL，the volumetric flask was placed in 20℃ for 10 minutes，and then the absorbance was detected at 500nm.According to the results，the line of range was from 4 μg/mL to 24 μg/mL， the relative standard deviation was 1.10％，and the recoveries were from 98.06％to 103.89％.The results proved that this method could be used for the determination of proanthocyanidins in purple yam.

vanillin-HCl method； procyanidins； purple yam

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.031

2016-11-28

郑州市普通科技攻关项目（153PKJGG424）；2015年度河南省高等学校优秀教学团队建设;2014年度河南省高等学校“专业综合改革试点”项目

王彦平（1983—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品功能㈦营养因子。

*通信作者：陈月英（1964—），女（汉），教授，硕士，研究方向：功能性食品。