琼脂-孔洞扩散法测定物质抑菌活性中相关影响因素的探讨

李萍，张兰，舒展，胡矗垚，闫静坤，汪青青

(天津农学院 基础科学学院，天津 300384)

琼脂-孔洞扩散法测定物质抑菌活性中相关影响因素的探讨

李萍，张兰，舒展，胡矗垚，闫静坤，汪青青

(天津农学院 基础科学学院，天津 300384)

以肉桂醛、索氏和超声波提取的肉桂油为试样，讨论样品加入量、浓度、打孔直径及评价指标对琼脂-孔洞扩散法测定物质抑菌活性的影响。结果表明：抑菌活性与样品加入量和浓度都呈正相关，9,11 mm孔径的加液量分别为50～70 μL 和70～90 μL比较适宜，应用2倍或3倍梯度稀释法可进行定量分析，较快找到被测物质对供试菌种的最小抑菌浓度。采用样品抑菌圈直径与空白抑菌圈直径的差值作为抑菌活性的评价指标比抑制率更加合理。GC-MS分析表明：索氏和超声波提取的肉桂油主要成分都是肉桂醛，含量分别为60.93%和37.86%。肉桂醛的抑制活性好于索氏和超声波提取的肉桂油，说明肉桂醛也是肉桂油的主要抗菌成分之一。肉桂醛、索氏和超声波提取的肉桂油均对细菌的抑制作用最强，其次是酵母，对霉菌的抑制作用较弱，但浓度为333.33 mg/mL的3种试样对黑曲霉的抑制率分别为60.00%，52.63%和47.06%，展现了一定的抑菌效果。肉桂油作为天然植物源抗菌剂用于食品保鲜领域具有一定的参考价值。

抑菌活性；琼脂-孔洞扩散法；样品加入量；样品浓度；孔径大小；评价指标

抑菌活性是许多物质可以作为防腐剂用于食品保鲜的重要原因。随着人们对化学防腐剂可能给人类健康和环境带来副作用的关注，科研人员对天然物质的抑菌活性及其在食品保鲜上的应用展开了大量研究[1-3]。目前，评价物质抑菌活性的方法有：滤纸片法、牛津杯法、琼脂-孔洞扩散法等。滤纸片法是将浸泡过一定浓度药液的滤纸片贴在含菌平板培养基表面，培养后观察有无抑菌圈，测量直径，评价抑菌活性[4,5]，此法的缺陷是如果滤纸片粘附不牢固，会导致抑菌圈轮廓模糊，测量误差较大，且滤纸片吸收的药液量不好控制，结果重复性较差；牛津杯法是向垂直置于培养基表面的牛津杯中注入药液，培养后观察有无抑菌圈，测量直径，评价抑菌活性[6,7]，此法所得抑菌圈轮廓清晰，结果可靠，但缺点是多个浓度测定时牛津杯需要个数较多，价格昂贵，操作成本高。琼脂-孔洞扩散法，又称打孔法，是用打孔器在含菌平板上打孔，向孔中加入样品溶液，培养后观察有无抑菌圈，测量直径，评价抑菌活性，此法操作简单，成本低，所得抑菌圈轮廓清晰，结果可靠，在物质的抑菌活性评价中得到广泛应用[8,9]。然而，在打孔法的实际操作中，往往由于样品加入量、浓度、打孔直径及评价指标等因素的影响，即使是对相同物质进行抑菌活性的测定，不同文献报道的结果也会存在较大差异，可比性较差。

先前实验中，我们发现肉桂醛及肉桂皮提取物对多种微生物具有抑菌活性[10]。因此，本文以肉桂醛、索氏和超声波提取的肉桂油为试样，对琼脂-孔洞扩散法测定物质抑菌活性中的相关影响因素，如样品加入量、浓度、打孔直径、评价指标等进行探讨，旨在为此法的可操作性和提高不同实验人员对相同物质抑菌活性测定结果的可比性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

供试样品：肉桂醛，纯度 98%，上海阿拉丁试剂有限公司；索氏提取的肉桂油，根据文献[11]方法制备；超声波提取的肉桂油，根据文献[12]方法制备。菌种：恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、酿酒酵母、黑曲霉，均由天津农学院农学与资源环境学院生物技术实验室提供，4 ℃斜面保存，用前活化。

1.2 药品与仪器

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分析纯；正己烷：色谱纯，天津市光复精细化工研究所；细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，酵母用酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，霉菌用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

移液枪 德国Eppendorf公司；灭菌锅(DX-35BI型)、DX-35BI型立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；Thermo Scientific MSC-Advantage Ⅱ级生物安全柜 德国Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-S型恒温恒湿培养箱 广东省医疗器械厂；打孔器1套。

1.3 实验方法

1.3.1 气相色谱-质谱(GC-MS)测定肉桂油中肉桂醛的含量

索氏和超声波提取的肉桂油用正己烷稀释进样。色谱和质谱条件参见文献，采用NIST2008标准谱库检索，利用峰面积归一化法计算各组分相对百分含量。

1.3.2 抑菌活性的测定

1.3.2.1 菌悬液的制备

细菌用平板稀释法测定菌落数，酵母菌用血球计数法计算菌落数[13]，分别用无菌生理盐水稀释，制成含菌数为107cfu/mL的菌液。霉菌用无菌生理盐水冲洗并收集孢子，制成孢子数为107个/mL的菌液。

1.3.2.2 琼脂-孔洞扩散法测定抑菌活性

灭菌培养基冷至50 ℃，加入5 mL菌悬液，混匀，倒入培养皿中(直径9 cm)，每皿15～20 mL，放置40 min，使培养基固化。用无菌打孔器在培养基上均匀打孔，向孔中加入试样，DMF作空白对照。细菌37 ℃培养24 h，酵母菌28 ℃培养48 h，霉菌25 ℃培养72 h。测量抑菌圈直径(单位mm)，每个浓度重复3次，计算样品抑菌圈直径(D)与空白抑菌圈直径(d)的差值，同时按公式(1)计算样品对菌种的抑制率。

公式(1)

1.3.3 样品加入量对抑菌活性的影响

3种供试样品用DMF作溶剂，配制的初始浓度均为1000.00 mg/mL，采用3倍梯度稀释法配制系列溶液。预实验表明：肉桂醛对细菌的抑制活性比酵母和霉菌强，索氏和超声波提取的肉桂油对供试菌种的抑制活性均小于肉桂醛，因此，为了得到大小适中的抑菌圈，便于测量，细菌(恶臭假单胞菌和枯草芽孢杆菌)实验时肉桂醛浓度为12.35 mg/mL，酵母(啤酒和酿酒)和霉菌(黑曲霉)实验时肉桂醛浓度为37.04 mg/mL。索氏和超声波提取的肉桂油对5种供试菌种实验浓度均为111.11 mg/mL。3种样品加入量分别为30,50,70,90 μL，打孔直径为9 mm，讨论浓度和孔径一定的条件下，样品加入量的变化对抑菌活性的影响。

1.3.4 样品浓度对抑菌活性的影响

3种供试样品用DMF作溶剂，配制的初始浓度分别为1000.00 mg/mL，采用梯度稀释法配制系列溶液。3种样品对供试菌种实验浓度均为333.33，166.67,83.33,41.67 mg/mL。3种样品加入量都为40 μL，打孔直径为9 mm，讨论加入量和孔径一定的条件下，样品浓度的变化对抑菌活性的影响。

1.3.5 打孔直径对抑菌活性的影响

细菌实验时肉桂醛浓度为12.35 mg/mL，酵母和霉菌实验时肉桂醛浓度为37.04 mg/mL。索氏和超声波提取的肉桂油对供试菌种实验浓度均为111.11 mg/mL。样品加入量都为40 μL，打孔直径分别为7,9,11,13 mm，讨论样品加入量和浓度一定的条件下，打孔直径的变化对抑菌活性的影响。

1.3.6 抑菌活性评价指标的选择

讨论采用样品抑菌圈直径(D)与空白抑菌圈直径(d)的差值即(D-d)值和抑制率两种指标对抑菌活性评价的合理性。

2 结果与分析

2.1 样品加入量对抑菌活性的影响

打孔法测定物质抑菌活性时，孔中物质向四周扩散，在孔洞周围出现的抑菌圈越大，说明此物质对该菌抑制活性越强，反之越小。

表1 样品加入量对(D-d)值的影响

样品加入量(μL)菌种恶臭假单胞菌枯草芽孢杆菌啤酒酵母酿酒酵母黑曲霉肉桂醛3016．50±0．2915．50±0．2913．50±0．5812．25±0．297．00±0．585019．50±0．5819．00±0．5018．00±0．7617．75±0．769．00±0．877021．50±0．5020．75±0．7619．50±0．5819．00±0．8711．50±0．299024．25±0．5023．75±0．5022．25±0．2921．50±0．7614．00±0．50索氏肉桂油3013．50±0．2912．50±010．00±0．769．00±1．155．75±0．295016．75±0．7614．00±0．8713．50±1．1510．00±1．267．00±0．507019．00±0．5817．00±0．2915．75±0．7612．75±0．878．25±1．029020．75±0．7619．75±0．2917．75±0．8714．00±0．879．50±0．50超声肉桂油3010．00±1．049．25±0．588．00±0．297．00±0．293．00±0．765014．50±0．2912．50±1．1512．25±0．878．00±0．505．00±0．297017．50±1．2615．00±1．0414．50±0．2911．00±0．766．25±09019．00±017．00±1．1516．50±0．8713．00±0．768．00±0．29

图1 样品加入量对抑制率的影响 注：(a)为肉桂醛，(b)为索氏肉桂油，(c)为超声肉桂油。

由表1、和图1可知，当样品浓度和打孔直径一定的条件下，随着加入量的增加，3种样品对同种微生物的(D-d)值和抑制率都明显增大，抑菌活性增强，说明在达到完全抑制供试菌种之前，抑菌效果与样品加入量呈正相关。此外，在加入量相同时，3种样品均对细菌的抑制作用最强，其次是酵母，对霉菌的抑制作用较弱。还可以看出，无论采用(D-d)值还是抑制率作为评价指标，相同加入量的3种试样对5种微生物的抑制活性排序均为：肉桂醛>索氏肉桂油>超声肉桂油，说明肉桂醛是肉桂油的主要抗菌成分之一，这与Siddiqua等和李京晶等[14]报道的结果一致。GC-MS分析表明：索氏和超声波提取的肉桂油主要成分都是肉桂醛，含量分别为60.93%和37.86%，这也是索氏提取的肉桂油抗菌效果好于超声波法的有力证明。

样品加入量对抑菌活性影响的培养皿照片见图2。琼脂-孔洞扩散法抑菌圈形状完整，测定结果准确可靠。

图2 样品加入量对抑菌活性影响的培养皿照片

打孔法的实际操作中，样品加入量过少会导致抑菌圈过小，甚至没有抑菌圈，容易造成实验人员对被测物质抑菌活性的错误推断；样品加入量过多会导致在打孔直径一定的条件下，加样及平板倒置培养时药液容易溢出，因此，样品加入量应当适宜。9，11 mm是实验时经常采用的孔径大小。以每皿倾倒15～20 mL培养基为例，9 mm孔径时，样品加入量30 μL刚好铺满孔底部，50 μL约占孔洞1/2容积，70 μL约占2/3容积，100 μL可填满孔洞，因此加液量为50～70 μL比较适宜；同理，11 mm孔径时，加液量为70～90 μL比较适宜。

2.2 样品浓度对抑菌活性的影响

样品浓度的变化对抑菌活性的影响结果见表2和图3。

表2 样品浓度对(D-d)值的影响

图3 样品浓度对抑制率的影响 注：(a)为肉桂醛，(b)为索氏肉桂油，(c)为超声肉桂油。

由表2和图3可知，在样品加入量和打孔直径一定的条件下，随着浓度的增加，3种供试样品(D-d)值和抑制率都明显增大，抑菌活性增强，说明在达到完全抑制供试微生物之前，抑菌效果与样品浓度呈正相关，这与Muthuswamy等和Aly等[15]报道的结果一致。此外，虽然肉桂醛、索氏和超声波提取的肉桂油对黑曲霉抑制作用比细菌和酵母弱，但加样量为40 μL时，浓度为333.33 mg/mL的3种试样对黑曲霉的抑制率分别为60.00%，52.63%和47.06%，展现了一定的抑菌效果，说明肉桂油作为天然植物源抗菌剂用于食品保鲜领域具有一定的参考价值。还可以看出，无论采用(D-d)值(见表2)还是抑制率(见图3)作为评价指标，在样品加入量一定时，相同浓度的3种试样对5种微生物的抑制活性排序均为：肉桂醛>索氏肉桂油>超声肉桂油，这与样品加入量对抑菌活性的影响结果一致。

样品浓度对抑菌活性影响的培养皿照片见图4。

图4 样品浓度对抑菌活性影响的培养皿照片

打孔法的实际操作中，样品初始浓度过小会导致抑菌圈过小，甚至没有抑菌圈，容易造成实验人员对被测物质抑菌活性的错误推断；样品初始浓度也不宜过大，因为有些菌种的培养时间较短(如细菌，24 h)，在样品加入量一定的条件下，高浓度的样品在短时间内有可能不会完全扩散开，导致其抑菌圈直径有时没有下一个相邻稀释梯度的样品大，且样品初始浓度过大还会增加后续寻找最小抑菌浓度的工作量。因此，在预实验初步了解样品抑菌活性后，应该选择适宜的样品初始浓度，采用2倍或3倍梯度稀释法配制系列样品溶液可进行定量分析，较快找到被测物质对供试微生物的最小抑菌浓度。

2.3 打孔直径对抑菌活性的影响及抑菌活性评价指标的选择

图5 打孔直径对抑制率的影响 注：(a)为肉桂醛，(b)为索氏肉桂油，(c)超声肉桂油。

前面在讨论样品加入量和浓度对物质抑菌活性的影响时，采用(D-d)值和抑制率作为评价指标都可以得到相同结果，即随着样品加入量和浓度的增加，(D-d)值和抑制率都呈现增大的趋势。由图5(b)和图5(c)可知，索氏和超声波提取的肉桂油在加入量和浓度一定的条件下，采用抑制率作为评价指标，随着打孔直径的增加，样品对5种微生物的抑制率都呈现下降趋势，即打孔直径越大，抑制率越小，说明抑制率的数值与打孔直径密切相关。

表3 打孔直径对(D-d)值的影响

样品打孔直径(mm)菌种恶臭假单胞菌枯草芽孢杆菌啤酒酵母酿酒酵母黑曲霉肉桂醛718．00±0．5815．75±0．7615．25±0．5811．75±0．769．50±1．15917．00±1．1516．00±1．0414．75±0．8713．00±0．298．50±0．501117．00±0．7616．00±0．5814．00±0．2913．25±0．589．00±1．041317．00±0．7616．50±1．1515．50±0．8713．75±0．769．50±0．58索氏肉桂油715．00±0．2912．50±0．5811．75±0．769．75±1．316．25±0914．75±0．4713．25±1．1312．00±010．00±0．846．50±1．151114．75±0．2913．00±0．6111．50±0．2910．75±1．156．00±0．761315．25±0．5813．75±0．7611．25±0．589．75±0．766．00±0超声肉桂油710．75±0．2910．50±1．159．00±0．878．00±0．504．00±0．29910．25±1．139．75±0．508．50±0．848．00±1．154．25±0．291111．00±0．769．00±1．158．50±0．878．00±0．585．00±0．291311．50±0．589．00±1．049．00±0．878．50±0．584．50±0．29

由表3可知，采用(D-d)值作为评价指标，在加入量和浓度一定的条件下，随着打孔直径的增加，样品对5种微生物的(D-d)值都变化不大，说明(D-d)值与打孔直径基本无关。肉桂醛采用抑制率(见图5a)和(D-d)值(见表3)作为评价指标与索氏和超声波提取的肉桂油体现出相同的规律。因此，采用样品抑菌圈直径(D)与空白抑菌圈直径(d)的差值，即(D-d)值作为物质抑菌活性的评价指标可以排除打孔直径对抑菌活性评价的影响，更加合理。其优势在于具有同一性，即在样品加入量和浓度相近的条件下，可以根据(D-d)值直接比较不同实验人员对相同物质抑菌活性的测定结果。

打孔直径对抑菌活性影响的培养皿照片见图6。

图6 打孔直径对抑菌活性影响的培养皿照片

打孔法的实际操作中，7 mm孔径较小，样品加入量有限，有时甚至不出现抑菌圈；13 mm孔径过大，样品加入量需要较多，不仅造成浪费，而且有时产生的抑菌圈过大，容易出现相邻稀释梯度的抑菌圈发生部分重合的现象，影响测量结果的准确性。9，11 mm是实验经常采用的孔径大小，且操作时同一个平板中打孔个数以4～5个比较适宜。

3 结论

琼脂-孔洞扩散法操作简便、成本低、准确性较高，是测定物质抑菌活性的常用方法之一。本文以肉桂醛、索氏和超声波提取的肉桂油为试样，讨论样品加入量、浓度、打孔直径及评价指标对琼脂-孔洞扩散法的影响，结论如下：在达到完全抑制供试菌种之前，抑菌活性与样品加入量和浓度都呈正相关，9，11 mm孔径的加液量分别为50～70，70～90 μL比较适宜。在选择适宜样品初始浓度前提下，应用2倍或3倍梯度稀释法可进行定量分析，较快找到被测物质对供试菌种的最小抑菌浓度。采用样品抑菌圈直径(D)与空白抑菌圈直径(d)的差值，即(D-d)值作为抑菌活性的评价指标比抑制率更加合理。GC-MS分析表明：索氏和超声波提取的肉桂油主要成分都是肉桂醛，含量分别为60.93%和37.86%。肉桂醛的抑制活性好于索氏和超声波提取的肉桂油，说明肉桂醛也是肉桂油的主要抗菌成分之一。肉桂醛、索氏和超声波提取的肉桂油均对细菌的抑制作用最强，其次是酵母，对霉菌的抑制作用较弱，但浓度为333.33 mg/mL的3种试样对黑曲霉的抑制率分别为60.00%，52.63%，47.06%，展现了一定的抑菌效果，说明肉桂油作为天然植物源抗菌剂用于食品保鲜领域具有一定的参考价值。

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Study on the Related Factors of Antimicrobial Activity byAgar-Hole Diffusion Method

LI Ping, ZHANG Lan, SHU Zhan, HU Chu-yao, YAN Jing-kun, WANG Qing-qing

(College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

The effects of sample additive amount, sample concentration, pore size and evaluation index on the antimicrobial activity of substances by agar-hole diffusion method are discussed in the paper using cinnamaldehyde,soxhlet and ultrasonic cinnamon extracts as materials.The results reveal that the antimicrobial activity is positively correlated with the amount and concentration of samples, and the appropriate additive amount of samples is 50～70 μL for 9 mm pore size and 70～90 μL for 11 mm pore size respectively. Moreover, 2 or 3 times gradient dilution method could be used for quantitative analysis to quickly find the minimum inhibitory concentration of the tested substances against the tested strains. In addition, it is more reasonable to use the difference between the inhibition zone diameter of the sample and the control than the inhibition rate as the evaluation index for determining antimicrobial activity.Cinnamaldehyde is the major component in cinnamon oil identified by GC-MS,and the content is 60.93%for soxhlet extract and 37.86% for ultrasonic extract respectively. Cinnamaldehyde shows better antimicrobial activity than soxhlet and ultrasonic extracts, which indicates that cinnamaldehyde is also one of the predominant antibacterial components in cinnamon oil. Cinnamaldehyde, soxhlet and ultrasonic cinnamon extracts all show the strongest inhibitory effect on bacteria, followed by yeast and the inhibition of mold is weaker, however, the inhibitory rates againstAspergillusnigerare 60.00%, 52.63% and 47.06% for the above three samples respectively at a concentration of 333.33 mg/mL, which shows a degree of inhibitory effect against the tested mold. It could be concluded that cinnamon oil could be explored as a good source of natural compound with significant antimicrobial activity for the development of food preservation.

antimicrobial activity；agar-hole diffusion method；sample additive amount；sample concentration；pore size；evaluation index

2017-02-10

李萍(1979-)，女，天津人，讲师，硕士，研究方向：香辛料有效成分的提取和应用。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.08.010

1000-9973(2017)08-0047-06