良性婴儿癫痫PRRT2基因突变及遗传特点研究①

刘文婷，Rakshya Koirala，王菊莉

(1.佳木斯大学康复医学院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003；3.佳木斯市中心医院癫痫中心，黑龙江 佳木斯 154003)

良性婴儿癫痫PRRT2基因突变及遗传特点研究①

刘文婷1，Rakshya Koirala2，王菊莉3

(1.佳木斯大学康复医学院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003；3.佳木斯市中心医院癫痫中心，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：检测PRRT2基因在散发性良性婴儿癫痫(benign infantile epilepsy，BIE)及家族性良性婴儿癫痫(benign familial infantile epilepsy，BFIE)患者中的突变情况及探究其遗传特点。方法：收集在佳木斯市中心医院癫痫中心诊断为良性婴儿癫痫患者，共8例散发性，一个BFIE伴阵发性运动诱发性运动障碍(Paroxysmal Kinesigenic Dyskinesia，PKD)家系共13例，其中4例患病，2例为BFIE，2例为PKD，签署知情同意书，采集外周静脉血5mL，通过直接测序的方法测取PRRT2基因突变情况，选取10例健康者作为对照组。采集病史及家族史，对PRRT2基因突变情况及遗传特点进行分析。结果：8例散发患者PRRT2基因无突变；家系中的4例患者均发现c.640_641insC，符合常染色体显性遗传的特点。结论：PRRT2基因突变可导致BFIE和PKD，且遗传符合常染色体显性遗传特点；同一突变点c.640_641insC可导致同一个家族出现BFIE和PKD，具有遗传多样性；PRRT2基因突变可能不是导致散发BIE的主要原因。

良性婴儿癫痫；PRRT2；遗传特点

癫痫(epilepsy) 是一种普通的常见神经系统疾病，我国约患病率3.5‰ ～ 4.8‰[1]。庆幸的是，通过正规合理的应用抗癫痫药物，约70% 的癫痫患者可以达到较为满意的效果[2]。婴儿期起病的良性局灶性癫痫，预后好。在2010年，国际抗癫痫联盟国际抗癫痫联盟(International league against epilepsy，ILAE)将此类癫痫分为良性婴儿癫痫及良性家族性婴儿癫痫。大量研究表明，癫痫和遗传因素有关[3]，2011年Chen等[4]在八个中国阵发性运动诱发性运动障碍(Paroxysmal Kinesigenic Dyskinesia，PKD)家族中发现了富脯氨酸跨膜蛋白2(proline-rich transmenbrane protein 2，PRRT2)突变。此后，一些研究[5]也发现PRRT2突变出现在BFIE中。本实验将研究中国汉族人中散发性BIE患者及BFIE家系PRRT2基因突变情况。

1 对象和方法

1.1 对象入选标准

纳入标准：①汉族，年龄、性别无要求； ②经癫痫科医师确诊为BIE及BFIE，包括接受药物治疗和未接受药物治疗者。如头颅CT或者MRI及脑电图均正常；③同意参与本研究并且患者本人或者其监护人签署知情同意书。

排除标准：①患有严重的器官衰竭者、传染病、血液及内分泌系统疾病者；②不愿配合本研究者。

1.2 一般资料

本研究对象分为散发性BIE和家族性BIE，其中8例散发患者，及1个家系共13例，患病者4例。抽取外周静脉血5mL，分别为Ⅱ代中的5号和6号，Ⅲ代中的3号、4号和5号、Ⅳ代中的1号以及所有散发患者，进行PRRT2基因检测，同时选10例健康人作为对照组。本研究家系中Ⅳ1为先证者，诊断为BFIE，Ⅲ3为先证者舅舅，也诊断为BFIE，先证者母亲及外婆，即Ⅲ5及Ⅱ6，均在少年早期患PKD。家系其他成员均健康，家系中Ⅰ代中的男性已去世。家系图谱如图1。收集病史及家族史，所有研究对象均经佳木斯中心医院癫痫中心诊断为BIE，诊断符合国际抗癫痫联盟(ILAE)的诊断标准。研究对象全部来自黑龙江省佳木斯市中心医院癫痫中心门诊及住院部，所有研究对象均签署知情同意书。

图1 BFIE/PKD家系图谱

1.3 实验方法

1.3.1 血清DNA提取:采静周围脉血5mL，采用Qiagen FlexiGene DNA Kit提取试剂盒提取血清DNA，-20℃保存。

1.3.2 引物设计:应用引物设计软件Primer5.0对PRRT2基因的3个外显子区域进行引物的设计，设计的引物由北京康旭医学检验所合成。引物序列见表1。

1.3.3 PCR反应:稀释引物，根据引物条件进行PCR扩增，PCR反应体系配制见表2。

1.3.4 DNA测序:对所得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，进行鉴定、纯化及回收产物，由北京康旭医学检验所测序。在BLAST上对测序结果进行比对分析。

表1 PRRT2引物序列

注：F:正向；R：反向。1F、2F、2R、3F、3R、4F、4R、5R反应条件：95℃预变性10min，94℃ 30s、 63℃ 30s、72℃ 45s 扩增34个循环，72℃延伸5mins，4℃放置。1R反应条件：95℃预变性10min，94℃ 30s、 64℃ 30s、72℃ 45s 扩增34个循环，72℃延伸5mins，4℃放置。5F反应条件：95℃预变性10min，94℃ 30s、 62℃ 30s、72℃ 45s 扩增34个循环，72℃延伸5mins，4℃放置。

表2 PCR反应体系

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行分析，由于总样本量n<40，因此用Fisher确切概率法进行对比，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 家系患者PRRT2基因检测结果及分析

该家系中有4位患者，其中两位为BIE(Ⅳ1、Ⅲ3)，两位为PKD(Ⅱ6、Ⅲ5)。在接受检测的成员中此4例患者均检测出了PRRT2基因杂合突变，该突变点位于chr16:29825015，为c.640_641insC杂合突变(如图3)。10例健康对照组未检测出突变(如图2)。Fisher确切概率法分析得出该家族的患者基因突变频率有统计学意义(P=0.001，P<0.05)见表3。该家系BFIE患者和PKD患者基因突变频率均有统计学意义，见表4、5。说明该基因突变的致病性可信。

表3 家系患者组与健康对照组PRRT2基因突变频率分析比较

注：P=0.001，P<0.05。

表4 BFIE组与健康对照组PRRT2基因突变频率分析比较

注：P=0.015，P<0.05。

表5 PKD组与健康对照组PRRT2基因突变频率分析比较

注：P=0.015，P<0.05。

c.640_641insC为编码区第640_641号核苷酸间插入C的杂合核苷酸变异，该变异导致从第217号氨基酸Arg开始的氨基酸合成发生改变，并在改变后的第8个氨基酸终止(p.Arg217ProfsTer8)，为移码变异，蛋白质功能可能因此受到影响。该变异在人群中的发生频率极低，从1000Genomes和dbSNP数据库也可知该变异不属于多态性变化。

图2 正常对照基因测序图

图3 突变基因测序图

2.2 散发BIE患者基因检测结果

8例散发患者均未检测出PRRT2基因突变，突变频率为0，与健康对照组突变频率一致。

2.3 家系遗传学特征

由图1可知，该家系连续3代人发病，Ⅱ6、Ⅲ3、Ⅲ5、Ⅳ1都具有PRRT2基因杂合突变，且都患病。Ⅱ6与Ⅲ5和Ⅳ1为直系亲属，Ⅱ6与Ⅲ3为直系亲属，符合孟德尔常染色体显性遗传规律。由于Ⅰ代中的男性已去世，所以无法追踪此突变遗传是否伴有不全外显。该家族4例患者同一个突变点却患有两种病症，且都只是单纯患有BIE或者单纯患PKD，没有BIE转换为PKD，也没有PKD伴有BIE。说明PRRT2基因突变具有遗传多效性。

3 讨论

Fukuyama[6]在1963年第一次报告婴儿良性癫痫后,随着对婴儿良性癫痫的深入研究，其诊断标准也不断地被改进，我国一般采用刘等[7]提出的诊断标准, 本研究收集的患者对单一抗癫痫药物反应好，预后好，符合诊断标准。本研究收录的8例患者均未检测出PRRT2基因突变，虽然有报道[8]散发性BIE患者PRRT2基因检测出突变，突变率为28.5%，而日本一关于散发性BIE的研究也未发现PRRT2基因突变[9]。表明PRRT2可能不是散发性婴儿良性癫痫的主要致病基因，或者提示中国汉族人种的散发的良性婴儿癫痫患者PRRT2基因突变率低，亦可能与本病散发病例例数偏少有关，或可能存在末端调控序列突变或者外显子丢失等机制，不能被常规检测方法所检测出。因此，对于散发性良性婴儿癫痫的主要致病基因的研究应该转向其他基因，如KCNQ2基因和KCNQ3基因等。

c.640_641insC为编码区第640_641号核苷酸间插入C的杂合核苷酸变异，有报告将c.640_641insC写成c.649dupC(p.R217PfsX8)或者c.649_650insC[9]，这三种不同的写法都表示该变异导致从第217号氨基酸Arg开始的氨基酸合成发生改变，并在改变后的第8个氨基酸终止(p.Arg217ProfsTer8)，为移码变异，蛋白质功能可能因此受到影响。该变异在正常人群中的发生频率极低，从1000Genomes和dbSNP数据库可知该变异不属于多态性变化。

近几年来，随着国内外对PRRT2研究越来越广泛和深入，一些研究报告在其他疾病中也发现了PRRT2基因的突变点c.649_650insC[10,11]。韩国报道一患有PKD伴BIC且在发作期发现中央颞区棘波(centrotemporal spikes,CTS)的10岁女孩，在基因检测中发现c.649_650insC[10]。 有研究报道一例患有发作性过度运动障碍(paroxysmal hypnogenic dyskinesia,PHD)的患者也发现该突变位点c.649_650insC[11]。以上研究进一步证实了PRRT2基因突变具有遗传多效性。 一个基因甚至一个基因位点突变可导致如此多病症，因此有人推测上述一系列发作性神经系统疾病在遗传学方面可能属于同一种疾病，只是临床表现不同而已，由此提出PRRT2相关疾病这一概念[12]。最近一研究在一阵发性运动源性运动障碍伴婴儿惊厥(paroxysmal kinesigenic dyskinesia with infantile convulsion,PKD/IC)的患儿身上发现了PRRT2内含子突变，其母亲患有PKD，因此该研究者提出此内含子突变可能是导致这个家族患病的原因，由于移码或者提前终止密码子而使PRRT2蛋白功能可能紊乱[13]。由此提醒我们，在研究PRRT2致病的机理时，也应该注意其内含子的作用。本研究由于条件有限未进行内含子的检测。

同样日本一研究也对一个BFIE/PKD家系进行了PRRT2基因检测，与本研究结果一致，BFIE及PKD患者检测出c.649_650insC突变，而j家族成员中健康者未检测出该基因突变[9]。关于PRRT2基因突变引起的一系列疾病的研究发现，有超过80%的家族性BIE有PRRT2基因突变[14]。本研究该家系如此高突变频率也在一定程度上佐证了这一观点。综上所述，在对家族性BIE患者做PRRT2基因检测是有必要的，而对散发性BIE患者做PRRT2基因检测的必要性还需进一步研究探讨。

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Highlights: Objective: To detect the PRRT2 gene mutation and explore genetic characteristics in patients with sporadic benign infantile epilepsy (BIE) or benign familial infantile epilepsy (BFIE). Methods: 8 cases of sporadic BIE diagnosed by Jiamusi Central Hospital were collected. A family of 13 people, 2 person had BFIE and 2 person had paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) were used in this study. All participants were signed a written informed consent. 5ml peripheral venous blood was collected from participants. PRRT2 gene mutation sequencing were directly measured. 10 healthy subjects were selected as control group. History and family history were collected to analyze the PRRT2 gene mutation and genetic characteristics. Results: There was no PRRT2 gene mutation in 8 sporadic patients. C.640_641insC was found in all 4 patients of the family. Conclusion: PRRT2 gene mutation can lead to BFIE and PKD, and satisfied the genetic characteristics of autosomal dominant inheritance; the same mutation point c.640_641insC can lead to BFIE and PKD in a family with genetic diversity; PRRT2 gene mutation may not be the main cause of sporadic BIE.

Study on PRRT2 gene mutation and genetic characteristics of benign infantile epilepsy

LIUWen-ting1,RakshyaKoirala2,WANGJu-li3

(1. College of Rehabilitation Medicine in Jiamusi University, Jiamusi 154003,China; 2. College of Clinical Medicine in Jiamusi University, Jiamusi 154003,China; 3. Epilepsy Center of Jiamusi Central Hospital, Jiamusi 154003,China)

BIE; PRRT2;genetic characteristics

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：YM2016_090。

刘文婷(1989～)女，陕西渭南人，在读硕士研究生。

王菊莉(1964～)女，黑龙江佳木斯人，博士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：wjll98981@163.com。

R722.19

B

1008-0104(2017)04-0032-04

2016-12-12)