盐酸埃克替尼对人非小细胞肺癌HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响

李磊 钟敏钰 宋海斌

·论著·

盐酸埃克替尼对人非小细胞肺癌HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响

李磊 钟敏钰 宋海斌

目的 探讨盐酸埃克替尼(Icotinib)对人非小细胞肺癌(NSCLC)HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响。方法 通过噻唑蓝比色(MTT)法检测Icotinib对HCC827细胞增殖的影响，流式细胞仪观察Icotinib对HCC827细胞凋亡的诱导作用，采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、胞外信号调节激酶(ERK)、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平。结果 Icotinib抑制HCC827细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用具有浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)；随着Icotinib对HCC827细胞作用的药物浓度升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平均明显下调(P<0.05)。结论Icotinib可能通过抑制EGFR下游信号通路蛋白的表达，进而有效抑制HCC827细胞的增殖和诱导HCC827细胞的凋亡。

盐酸埃克替尼；非小细胞肺癌；凋亡；表皮生长因子受体

肺癌是发病率较高的恶性肿瘤疾病，由于临床上缺乏灵敏且有效的早期诊断指标，大多数肺癌患者确诊时已处于晚期阶段，而上述患者仅能采取放化疗或靶向性治疗[1]。近些年随着研究人员对靶向性治疗认识的不断深入，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epider-mal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)已成为治疗晚期非小细胞肺癌(non-small-cell carcinoma,NSCLC)的新型措施，而表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)突变患者疗效更为显著[2]。盐酸埃克替尼(Icotinib)是一种新研制而成的EGFR-TKI，可特异性和竞争性的与EGFR酪氨酸激酶功能区相互结合，进而有效抑制其生理活性功能，最终起到阻断肿瘤细胞增殖、凋亡等相关信号传导通路的药理作用[3-5]。本研究拟探讨Icotinib对人非小细胞肺癌HCC827细胞凋亡及EGFR下游信号通路蛋白表达的影响，为Icotinib的临床应用提供有利的实验依据。

1 资料与方法

1.1 研究细胞及实验试剂 人非小细胞肺癌HCC827细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，Icotinib购自浙江贝达药业有限公司，RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，四甲基偶氮唑(MTT)购自华美生物公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD公司，兔抗人EGFR、蛋白激酶B(AKT)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin抗体均购自Cell Signaling公司。

1.2 细胞培养方法 HCC827细胞由本实验室根据常规方法在RPMI 1640培养液(内含10%浓度的胎牛血清、12 kU/L浓度的庆大霉素)，37℃、饱和湿度及5%CO2的孵育箱内进行传代培养，0.25%胰酶消化液予以消化传代，每间隔2～3 d传代一次。

1.3 MTT检测方法 将生长良好的HCC827细胞制备成细胞悬液，使得细胞浓度为1×105/ml，在培养板中依次进行接种，每孔加入90 μl细胞悬液，分别在每孔内加入Icotinib培养液，使孔内Icotinib药物终浓度为0.1、1 μmol/L。另设阴性对照组及空白组，各设置6个复孔进行对比研究。在细胞培养箱中分别培养24、48、72 h后，加入100 μl体积的MTT溶液，室温条件下培养4 h后离心处理后吸弃上层细胞培养液，然后将100 μl体积的DMSO依次加入每孔，与孔内液体充分溶解15 min。采用A570nm对每孔的OD值进行检测，并计算细胞生长抑制率。

1.4 细胞凋亡率检测 采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒对细胞凋亡率进行检测，具体方法按照试剂盒说明书进行操作。取对照组与0.1、1 μmol/L Icotinib药物浓度处理8 h、16 h和24 h的HCC827细胞，PBS溶液洗涤2次，调整细胞浓度为1×106/ml，吸取100 μl细胞溶液到EP管，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI试剂相互混匀，室温避光孵育15 min，然后加入400 μl×Binding buffer，1 h内送流式细胞仪予以检测。

1.5 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达 将对数生长期的HCC827细胞接种在6孔板(2×105个/孔)，待细胞培养贴壁后分别加入药物浓度为0.1和1 μmol/L的Icotinib。药物作用24 h后收集HCC827细胞，裂解处理后12 000 r/min离心25 min，吸取细胞上清液，采用Western blot对EGFR、AKT、ERK、p-EGFR、p-AKT、p-ERK和Survivin蛋白予以定量检测。与3×样品缓冲液混合均匀后，在94℃温度条件下加热处理10 min，将样品予以SDS-PAGE电泳，从凝胶组织中将蛋白质物质转移至滤膜上，电泳转印处理后行Western Blot检测，一抗以1∶200予以稀释处理，二抗则以1∶750予以稀释处理，采用DAB试剂盒显色处理，如有蛋白质条带出现立即用大量PBS溶液冲洗以终止Western Blot反应过程，实验结果采用专用扫描仪器分析和处理，目的蛋白/GAPDH的灰度比值表示其蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1Icotinib对HCC827细胞增殖的影响 随着Icotinib药物浓度的逐渐增加，其抑制HCC827细胞增殖的作用逐渐增强(P<0.05)；随着Icotinib作用时间的延长，其抑制HCC827细胞增殖的作用也逐渐增强(P<0.05)。见表1，图1。

Icotinib浓度(μmol/L)生长抑制率24h48h72h空白对照组0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.124.02±6.18△38.10±7.51*△47.34±8.23*#△150.44±8.95△☆61.41±10.74*△☆72.25±9.92*#△☆

注：与24h比较，*P<0.05；与48h比较，#P<0.05；与空白对照组比较，△P<0.05；与0.1μmol/L比较,☆P<0.05

图1 3组不同时间点细胞生长抑制率比较

2.2Icotinib对HCC827细胞凋亡的诱导作用 随着Icotinib药物浓度的逐渐增加，其诱导HCC827细胞的凋亡率逐渐升高(P<0.05)；随着Icotinib作用时间的延长，其诱导HCC827细胞的凋亡率也逐渐升高(P<0.05)。见表2，图2。

Icotinib浓度(μmol/L)凋亡率8h16h24h空白对照组0.00±0.001.12±0.25*3.46±0.55*#0.17.62±2.65△10.27±3.71*△15.30±5.04*#△113.56±5.41△☆18.20±5.30*△☆23.16±5.92*#△☆

注：与8 h比较，*P<0.05；与16h比较，#P<0.05；与空白对照组比较，△P<0.05；与0.1μmol/L比较,☆P<0.05

2.3Icotinib对HCC827细胞EGFR下游信号通路蛋白表达的影响 随着Icotinib对HCC827细胞作用的药物浓度升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平均明显下调(P<0.05)。见表3，图3。

图2 3组HCC827细胞不同时间凋亡的流式细胞图

图3 3组HCC827细胞EGFR下游信号通路蛋白的表达(Western Blot)

Icotinib浓度(μmol/L)EGFR/GAPDHp-EGFR/GAPDHERK/GAPDHp-ERK/GAPDHAKT/GAPDHp-AKT/GAPDHSurvivin/GAPDH空白对照组0.978±0.1980.925±0.2100.728±0.1920.637±0.1420.870±0.1810.963±0.2610.826±0.189 0.10.957±0.1750.725±0.127*0.712±0.1550.471±0.086*0.854±0.1670.772±0.195*0.682±0.125* 10.921±0.1430.502±0.105*#0.707±0.1440.328±0.051*#0.821±0.1650.437±0.096*#0.414±0.087*#

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与0.1μmol/L组比较，#P<0.05

3 讨论

人类EGFR是Erb/HER家族的一个成员，与肺癌发生密切相关，在肺癌组织中常高表达，从而促进了肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、粘附、侵袭和转移。EGFR可在胞外相应配体的诱导作用下形成同源/异源二聚体，进而促进酪氨酸激酶的自磷酸化过程，明显激活活化下游的多条信号传导通路，最终对肿瘤细胞异常增殖、凋亡现象、远处转移及血管组织形成等予以有效调节和控制[6,7]。目前已知EGFR有RAS/MAPK/ERK和PI3K/AKT两条主要的信号传导通路等，EGFR的突变可使得其生理学活性功能显著性增强，进而持续激活活化处于下游的各种信号传导通路，有效刺激肿瘤细胞的异常增殖，在肿瘤疾病的发生、发展过程中占有十分重要的作用[8-10]。Icotinib是由我国研究人员最新研制而成的EGFR-TKI，在化学结构和作用机制等方面与吉非替尼、厄洛替尼等药物具有较高的相似性，且治疗效果无明显差异性，具有更高的安全可靠性[4]。Icotinib可有效抑制EGFR的自身磷酸化作用，从而明显阻止下游信号通路的激活活化过程。此外，Icotinib还可特异性和竞争性的结合EGFR酪氨酸激酶功能区，从而有效抑制其生理学活性功能，最终对肿瘤细胞增殖及凋亡等信号传导通路予以有效阻断[11,12]。本研究结果显示，随着Icotinib药物浓度的逐渐增加和作用时间的延长，其抑制HCC827细胞增殖的作用和诱导HCC827细胞的凋亡率均明显增强和升高，提示Icotinib抑制HCC827细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用具有浓度依赖性和时间依赖性(P<0.05)，此结果与国内外相关研究相符[7,13,14]。此外，还有研究为明确Icotinib在分子水平的激酶抑制选择性，检测其对88种激酶(包括EGFR-TK及其突变型)的抑制活性，结果显示盐酸埃克替尼仅对EGFR-TK及其突变型有显著抑制作用[15]。

本研究还发现，随着Icotinib作用浓度的升高，p-EGFR、p-AKT、p-ERK和survivin等EGFR下游信号通路蛋白的表达水平均明显下调。由此可知，Icotinib有效抑制了EGFR的自身磷酸化及EGFR下游信号通路蛋白的表达，进而有效抑制HCC827细胞的增殖和诱导HCC827细胞的凋亡。本研究还存在某些不足，如Icotinib对其他正常细胞的毒性作用，Icotinib抑制人非小细胞肺癌HCC827细胞增殖和诱导凋亡的最佳剂量，这些均需要进一步深入研究。

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The influence of icotinib hydrochloride on apoptosis of non-small cell lung cancer cell-HCC827 and the protein expression levels of EGFR downstream signaling pathways in vitro

LILei,ZHANGMinyu,SONGHaibin.

DepartmentofOncology,TheFirstHospitalofWuhanCity,Wuhan430022,China

Objective To investigate the influence of icotinib hydrochloride on apoptosis of non-small cell lung cancer cell (NSCLC)-HCC827 and the protein expression levels of EGFR downstream signaling pathways in vitro.Methods The influence of icotinib hydrochloride on proliferation of HCC827 cell was detected by MTT,and the effects of icotinib-induced apoptosis of HCC827 cell were observed by flow cytometry,moreover, the expression levels of EGFR signaling pathways downstream proteins including epidermal growth factor receptor (EGFR),protein kinase B (AKT),extracellular signal regulating EGFR kinase (ERK),p-EGFR,p-AKT,p-ERK and Survivin were detected by Western Blot.Results The icotinib hydrochloride had inhibitory effects on HCC827 cell proliferation and could induce apoptosis of HCC827,with a concentration dependent and time dependence manner (P<0.05).With the increase of icotinib concentration,the expression levels of EGFR signaling pathways downstream protein including p-EGFR,p-AKT,p-ERK and Survivin were significantly down-regulated (P<0.05).Conclusion The icotinib hydrochloride can effectively inhibit HCC827 cell proliferation and induce apoptosis of HCC827 cells by inhibiting the expressions of EGFR signaling pathways downstream protein.

icotinib hydrochloride; non-small cell lung cancer; apoptosis; epidermal growth factor receptor

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.17.006

430022 湖北省武汉市第一医院肿瘤科三病区

R

A

1002-7386(2017)17-2585-04

2017-04-17)