胃癌组织中miR-185检测的临床价值及与Vav3-Rac1通路的关系

檀碧波 李勇 范立侨 刘艳丽 刘庆伟

·论著·

胃癌组织中miR-185检测的临床价值及与Vav3-Rac1通路的关系

檀碧波 李勇 范立侨 刘艳丽 刘庆伟

目的 探讨胃癌及癌旁正常胃黏膜中微小RNA145(miR-185)、Vav3、Rac1基因的表达情况及关系。方法 荧光实时定量PCR技术检测100例胃癌组织及80例癌旁正常胃黏膜中miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA的表达情况。比较胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中这3种基因mRNA的表达差异；绘制受试者工作曲线(ROC曲线)；分析miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA表达与患者生物学特征的关系；分析胃癌组织中miR-185与Vav3、Rac1的关系。结果 胃癌组织中miR-185的表达低于癌旁正常胃黏膜组织，而Vav3、Rac1的mRNA表达则明显高于癌旁正常胃黏膜组织(P<0.05)。miR-185、Vav3、Rac1的ROC曲线最佳cut-off值分别为0.3440、0.3346、0.2944。miR-185的表达与胃癌的浸润深度、分化及淋巴结转移有关；Vav3、Rac1的表达与胃癌的分化及淋巴结转移有关(P<0.05)。Spearman相关分析显示，在胃癌组织中miR-185与Vav3、Rac1存在负相关，Vav3与Rac1存在正相关(P<0.05)。结论 胃癌组织中miR-185表达明显降低且与胃癌的生物学特征有关，miR-185可能通过抑制Vav3-Rac1通路而参与了胃癌进展的调控过程。

微小RNA-185；胃肿瘤；Vav3；Rac1；生物学特征

胃癌是我国常见恶性肿瘤，其发病率居于各种恶性肿瘤第二位，仅次于肺癌；死亡率居第三位，仅次于肺癌和肝癌，严重威胁人民健康[1]。虽然有关胃癌的诊治措施已研究多年。且已取得不少成果，但胃癌总的治疗效果还远不令人满意，患者大多预后较差[2]。因此，探讨胃癌发病机制并对于明确病因、寻找标志物、确定治疗靶基因有重要价值。胃癌的基因调控过程是复杂的网络式调控，近年来微小RNA(microRNA,miR)在胃癌中发挥的作用已引起了关注，成为本领域研究的热点。目前发现，多种miRs在胃癌的各进程中发挥了重要作用，研究显示miR-29c、miR-124、miR-135a and miR-148a、miR-421、miR-7等在预测胃癌淋巴结转移及预后等方面具有重要价值[3-5]，说明在胃癌的进展过程中miRs发挥了重要作用。本课题组前期研究发现对胃癌细胞株的miR-185表达进行调控可以改变肿瘤细胞的凋亡状态，还可以使肿瘤细胞的耐药特性发生变化[6,7]。这提示miR-185参与了胃癌的生物学进程，但在临床胃癌组织中miR-185检测的情况及价值还不明确。因此本研究以临床胃癌患者为研究对象，应用荧光实时定量聚合酶链反应(fluorescence real time quantitative polymerase chain reaction,QPCR)技术检测了100例胃癌组织及80例癌旁正常胃黏膜组织中miR-185的表达情况，绘制了受试者工作曲线(ROC曲线)，并分析了miR-185表达与胃癌患者生物学特征的关系。为初步了解miR-185在胃癌中可能的调节机制，本研究同时检测了Vav3、Rac1的表达，并分析了miR-185与Vav3、Rac1的关系，为深入探讨miR-185参与胃癌调控的研究提供了一定的临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1～12月于河北医科大学第四医院外三科诊治的胃癌手术患者100例，其中男76例，女24例；年龄32～81岁，平均年龄(60.19±8.63)岁。所有患者于肿瘤切除后尽快取肿瘤组织1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，同时于距肿瘤边缘>3 cm处取外观正常的胃黏膜组织。胃癌及黏膜组织均一式两份，一份送常规病理检查，确定是否符合实验要求(肿瘤组织要求病理诊断明确为腺癌，癌旁正常胃黏膜要求无癌细胞检出)；另一份以PBS漂洗干净后置于液氮中，尽快转至超低温冰箱于-80℃保存。患者的病理学特征：肿瘤均为腺癌，中高分化腺癌67例，低分化(未分化)腺癌33例；肿瘤未侵犯浆膜者32例，侵犯浆膜者68例；存在阳性淋巴结转移者78例，淋巴结转移阴性者22例；存在远处转移者11例，无远处转移者89例；血管神经受侵犯者65例，无侵犯者35例；按UICC第7版肿瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者42例，Ⅱ～Ⅳ期58例。本研究得到医院医学伦理委员会批准，并取得所有入组者的知情同意。

1.2 入选与排除标准

1.2.1 入选标准：①患者年龄>18岁；②初次确诊的胃癌患者，且接受手术治疗；③患者手术前未接受放疗、化疗、生物治疗、靶向治疗等措施；④患者均手术切除了原发病灶。

1.2.2 排除标准：①术后复发的胃癌患者；②合并其他恶性肿瘤的患者；③应用激素、免疫抑制剂等药物的患者；④不能配合或不同意参加研究的患者。

1.3 主要试剂与仪器 miR-185、Vav3、Rac1及内参照基因U6、GAPDH的QPCR引物由北京天根生化科技公司合成。QPCR检测试剂盒、QPCR试剂及反转录试剂盒均购自北京天根生化科技公司。荧光定量PCR仪(7300型)为美国ABI公司产品。

1.4 QPCR实验检测miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA表达情况 组织研磨破碎后提取总RNA，对总RNA的浓度和纯度进行鉴定后进行反转录，合成目的基因的cDNA。取反转录产物2 μl进行PCR反应。PCR反应体系组成为20 μl：2×miRcute miRNA Premix (或SYBR Green Mix)10 μl，目的基因的上下游引物各0.5 μl，反转录产物2 μl，RNase-Free ddH2O 7 μl。循环参数设置：94℃预变性，2 min，循环参数：94℃ 20 s模板变性，60℃ 34 s退火、延伸，共循环40次。结束后由软件自动进行循环阈值(CT)读取，以目的基因与内参基因的相对表达量代表目的基因表达强度。

2 结果

2.1 miR-185与Vav3、Rac1基因mRNA在胃癌组织、癌旁正常胃黏膜组织中的表达 QPCR结果显示，胃癌组织、癌旁正常胃黏膜组织中miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织中miR-185的表达低于癌旁正常胃黏膜组织，而Vav3、Rac1的mRNA表达则明显高于癌旁正常胃黏膜组织(P<0.05)。见表1。

类别miR-185Vav3mRNARac1mRNA胃癌组织(n=100)0.2780±0.08170.4272±0.13200.3833±0.1238癌旁组织(n=80)0.3751±0.12400.2695±0.09590.2058±0.0775t值-6.30638.958411.1865P值<0.01<0.01<0.01

2.2 胃癌组织中miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA的ROC曲线结果 结果显示，miR-185的ROC曲线最佳cut-off值为0.3440，曲线下面积0.735，其敏感度和特异度分别为58.8%、81.0%；Vav3的ROC曲线最佳cut-off值为0.3346，曲线下面积0.835，其敏感度和特异度分别为77.0%、77.5%；Rac1的ROC曲线最佳cut-off值为0.2944，曲线下面积0.892，其敏感度和特异度分别为75.0%、88.7%。见图1。

图1 miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA的ROC曲线结果

2.3 胃癌组织中miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA与胃癌生物学特征的关系 χ2检验结果显示，miR-185的表达与胃癌的zz浸润深度、分化及淋巴结转移有关(P<0.05)；Vav3、Rac1的表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移情况有关(P<0.05)。见表2。

表2 miR-185、Vav3、Rac1基因的mRNA在胃癌组织表达与生物学特征的关系 例

2.4 胃癌组织中miR-185、Vav3、Rac1基因mRNA表达的相关性 Spearman结果显示，miR-185与Vav3、Rac1存在负相关(r=-0.3622,P<0.01；r=-0.2854,P=0.004)，Vav3与Rac1存在正相关(r=0.5221,P<0.01)。

3 讨论

胃癌在我国为高发的恶性肿瘤，由于胃癌无特异性临床症状，因而很难早期发现并治疗。胃癌进展迅速，手术后易复发及转移，目前尚无针对胃癌的特效治疗方法，因而胃癌预后较差，5年生存率不足40%[8,9]。在胃癌的进展过程中，许多与胃癌调控相关的分子发挥了重要作用，其中微小RNA(microRNA,miR)与胃癌的关系已受到越来越多的关注。miRs的功能是通过靶向抑制作用，抑制受其调控的一组靶基因的表达。有研究发现，多种miRs在胃癌进展中发挥了重要的调节作用。Li等[10]研究发现，miR-183在胃癌中可以通过调控PDCD4而促进肿瘤进展，发挥了原癌基因的作用。Wu等[11]研究显示，miR-18a可以通过抑制缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达而调节胃癌细胞的凋亡及侵袭能力。另外Xu等[12]研究还发现miR-532可以通过调节RUNX3参与胃癌进展。这些都表明miRs在胃癌的进展中发挥了重要作用。miR-185也是miRs成员之一，有研究显示，miR-185在胃癌中表达下降，与胃癌进展关系密切[13]。我们的前期研究也发现，促进胃癌细胞中miR-185表达可以促进胃癌细胞凋亡；还发现提高胃癌细胞中的miR-185表达可以改善胃癌细胞对化疗药物的敏感性，抑制miR-185表达可以使胃癌细胞对化疗药物的敏感性降低[6-8]。但这些研究大多为基础研究，miR-185在胃癌组织中的表达及调控机制报道少见。本研究结果显示，miR-185在胃癌组织中表达低于癌旁正常胃黏膜组织，且miR-185在两种组织中表达存在正相关，提示miR-185表达下降可能是胃癌发生的因素之一，但具体情况还有待深入分析。

为了评价miR1-185检测的临床价值，本研究进一步对miR-185水平进行了分析，绘制了受试者工作曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)，对胃癌组织中miR1-185的检测价值进行了评价。结果显示，miR-185的ROC曲线最佳cut-off值为0.3440，曲线下面积0.735，其敏感度和特异度分别为58.8%、81.0%。我们按此标准将miR-185分为强表达及弱表达，并与胃癌患者的生物学特征进行分析，结果发现miR-185的表达与胃癌的肿瘤浸润深度、分化及淋巴结转移有关，浸润更深、分化程度差、存在淋巴结转移的患者miR-185水平更低。这提示miR-185可能参与了胃癌的进展及转移，并且在转移过程中其水平进一步降低，检测胃癌组织miR-185有可能对预测肿瘤转移有帮助。

为初步探讨miR-185在胃癌中发挥的调控机制，本研究同时检测了胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中Vav3、Rac1基因mRNA表达情况。Vav3基因是原癌基因家族Vav的成员之一，参与许多信号转导通路的调控，对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移有调节作用[13-15]。本课题组前期研究发现，胃癌细胞中Vav3表达增高，对胃癌细胞的生长、迁移等有促进作用[16]。我们的前期研究还发现，Vav3表达增高对胃癌细胞的凋亡有抑制作用，还能导致胃癌细胞耐药[17,18]。Rac1是直接受Vav3调控的基因，可以由Vav3激活[19]，Vav3-Rac1通路在胃癌细胞调控中发挥了重要作用。本研究发现，胃癌组织、癌旁正常胃黏膜组织中Vav3、Rac1基因mRNA表达存在差异，Vav3、Rac1的mRNA表达则明显高于癌旁正常胃黏膜组织，在胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中这两种基因的表达均存在正相关，提示这两种基因表达的增强可能与胃癌发生有关。我们同样也绘制了胃癌中Vav3、Rac1水平的ROC曲线，结果发现Vav3的ROC曲线最佳cut-off值为0.3346，曲线下面积0.835，其敏感度和特异度分别为77.0%、77.5%；Rac1的ROC曲线最佳cut-off值为0.2944，曲线下面积0.892，其敏感度和特异度分别为75.0%、88.7%。Vav3的表达与胃癌的分化及淋巴结转移有关；Rac1的表达与胃癌的分化及淋巴结转移有关。这些结果显示Vav3、Rac1基因与胃癌关系密切，值得深入研究。

本文应用Spearman相关分析研究了miR-185与Vav3-Rac1通路基因在胃癌组织中的关系，结果发现，在胃癌组织中miR-185与Vav3、Rac1均存在负相关，提示miR-185对Vav3、Rac1可能存在抑制作用，miR-185可能通过抑制Vav3、Rac1表达而抑制了胃癌的进展，但具体情况还有待相关基础研究予以证实。

综上所述，本研究发现miR-185在胃癌组织中表达低于癌旁正常胃黏膜，其表达降低可导致肿瘤分化方向停滞，侵袭能力增强。研究miR-185在胃癌中的表达规律对探讨胃癌进展机制、发现新的靶基因有重要意义。同时本研究还发现miR-185与Vav3-Rac1通路的表达有关，提示miR-185可能通过调节该通路而参与了胃癌的进展。但本文样本量不大，且没有进行机制分析，这些在今后的研究中准备进一步完善，在胃癌诊治领域做出贡献。

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Clinical significance of miR-185 detection in gastric cancer tissues and its relationship with Vav3-Rac1 pathway

TANBibo,LIYong,FANLiqiao,etal.

TheThirdDepartmentofSurgery,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the expression and relationship of miR-185,Vav3,Rac1 gene in gastric cancer tissues and adjacent normal tissues.Methods The expression levels of miR-185,Vav3,Rac1 mRNA were detected by fluorescence real time quantitative polymerase chain reaction (QPCR) assay in 100 cases of gastric cancer tissues and 80 cases of adjacent normal tissues.The expression differences of miR-185,Vav3,Rac1 were compared between gastric cancer tissues and adjacent normal tissues.The ROC curve was completed with data,and the correlation between the expressions of miR-185, Vav3,Rac1 mRNA and biological characteristics of patients was analyzed.Moreover the correlation among miR-185,Vav3,Rac1 in gastric cancer tissues was analyzed. Results The expression levels of miR-185 in gastric cancer tissues were obviously lower than those in adjacent normal tissues,however,the expression levels of Vav3,Rac1 mRNA were significantly higher than those in adjacent normal tissues (P<0.05). The optimized cut-off value of miR-185,Vav3,Rac1 under ROC curve was 0.3440,0.3346,0.2944,respectively. The expression of miR-185 was closely correlated to depth of invasion,differentiation extent and lymphatic metastasis of gastric cancer,moreover, the expressions of Vav3 and Rac1 mRNA were closely related with differentiation extent and lymphatic metastasis of gastric cancer (P<0.05). Spearman correlation analysis showed that there was an negative correlation between miR-185 and Vav3,miR-185 and there was a positive correlation between Vav3 and Rac1 (P<0.05).Conclusion The expression levels of miR-185 are obviously decreased in gastric cancer tissues,moreover,which are closely correlated to biological characteristics of gastric cancer,and miR-185 may be involved in progression of gastric cancer by regulating Vav3-Rac1 pathway.

miR-185; gastric cancer; Vav3; Rac1; biological characteristics

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.17.001

项目来源：国家自然科学基金面上项目(编号：81372580)；河北省自然科学基金面上项目(编号：H2016206173)；河北省科学技术研究与发展支撑计划项目(编号：14277779D)；河北省医科科学研究重点课题计划(编号：20160176)

050011 石家庄市，河北医科大学第四医院外三科(檀碧波、李勇、范立侨、刘庆伟)；中国人民解放军白求恩国际和平医院病理科(刘艳丽)

李勇，050011 石家庄市，河北医科大学第四医院外三科；

E-mail:Li_yong_hbth@126.com

R 735.2

A

1002-7386(2017)17-2565-05

2017-02-22)