电针对大鼠心肌缺血相关长链非编码RNA及mRNA表达谱的影响※

萨喆燕 潘晓华 黄倩茹 万隆 朱小香 董亚琴 许金森*

（福建省中医药研究院·福建省经络感传重点实验室，福建福州350003）

电针对大鼠心肌缺血相关长链非编码RNA及mRNA表达谱的影响※

萨喆燕 潘晓华 黄倩茹 万隆 朱小香 董亚琴 许金森*

（福建省中医药研究院·福建省经络感传重点实验室，福建福州350003）

目的探讨电针对心肌缺血大鼠心肌组织长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）表达的影响。方法18只SD大鼠随机分为模型组、电针组、生理盐水对照组，每组6只。模型组、电针组大鼠经皮下多点位注射盐酸异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）制备心肌缺血模型，电针组电针内关穴5 d，比较各组心电图ECG偏移幅度；采用lncRNA芯片检测电针组和模型组大鼠心肌组织lncRNA和mRNA的表达差异，筛选出电针治疗心肌缺血相关的lncRNA；实时荧光定量PCR验证3个随机挑选的lncRNA。结果相较于模型组，电针组ECG偏移较小，差异表达的lncRNA共547个，mRNA738个，PCR验证结果与芯片结果基本一致。结论与模型组比较，电针组大鼠lncRNA表达谱变化显著，lncRNA可能在电针治疗心肌缺血过程中发挥一定作用。

长链非编码RNA；心肌缺血；电针；心肌缺血

冠状动脉性心脏病，又称缺血性心脏病，占我国城乡居民总死亡原因的首位，并呈逐年增加趋势[1]。尽管人们对缺血性心脏病的认识不断提高，医疗手段也在不断进步，但该病仍严重影响人们的健康。国内外大量临床证实，针刺治疗心肌缺血的效应主要体现在缓解临床疼痛症状、抗心率失常、提高患者生活质量以及改善预后等方面[2-4]，但机制仍未完全阐明。

长链非编码核糖核酸(long noncoding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸单位，不编码蛋白质，但往往具有mRNA结构特征的小分子RNA。本研究采用盐酸异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）造成心肌缺血大鼠模型，通过电针治疗，对大鼠缺血心肌组织标本进行lncRNA/mRNA芯片分析，以期了解电针对缺血心肌组织中lncRNA表达的影响，为针刺治疗心肌缺血的机制研究提供新的思路和线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组雄性SD大鼠18只，体质量230～250 g，清洁级，由福建省中医药研究院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(闽)2012-0001。饲养条件：温度25℃，12 h明暗交替，自由摄食饮水。按随机数字表法分为生理盐水对照组、模型组、电针组，每组6只。

1.2 药品与试剂ISO（美国Sigma公司）；RNA酶抑制剂（美国Epicentre公司）；RT缓冲液（美国Invitrogen公司）；PrimeScript逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；引物由上海康成生物工程有限公司设计并合成。

1.3 仪器Powerlab多导数据采集分析系统（澳大利亚埃德公司）；小动物麻醉呼吸系统（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；7500 Fast Real-Time PCR System（美国Applied Biosystems公司）；梯度荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。SDZ-II型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）。lncRNA及mRNA基因芯片服务由上海康成生物公司提供。

1.4 研究方法

1.4.1 动物造模大鼠连接小动物麻醉呼吸机，吸入异氟烷麻醉，通过多导生理记录仪记录正常状态下大鼠心电图ECG。按每日85 mg/kg剂量在大鼠四肢内侧根部和背部注射ISO，连续注射2日。根据ECG出现T波由正向变为负向或呈双相，S-T段抬高确认造模成功。

1.4.2 干预措施电针组以0.25 mm×13 mm华佗牌无菌毫针直刺左侧内关穴，连接SDZ-II电针仪，电压5～10 V，以针体轻微抖动为度，疏密波，频率2/10 Hz，每次20 min，每日1次。第2次注射ISO后24 h开始治疗，连续5 d。生理盐水对照组和模型组给予同等条件抓取，不做任何治疗。

1.4.3 样本采集干预结束后，大鼠腹腔注射过量10%水合氯醛处死，立即取新鲜左心室心肌组织-80℃保存用于lncRNA检测。

1.4.4 ECG分析干预结束后分别记录对照组、模型组、电针组大鼠的ECG，各取5个心动周期，以TP连线为基线，测量J点电位偏移和T波振幅变化，作为评价心肌缺血程度的指标。

1.4.5 芯片选择采用美国Arraystar公司大鼠lncRNA微阵列芯片v2.0，能够检测13，611个lncRNAs和24，626个蛋白质编码转录本。lncRNAs是从权威数据库（包括NCBI RefSeq、Ensembl、LncRNAdb等）和高影响因子论文中收集的。

1.4.6 RNA提取取出新鲜冻存的心肌组织，剪成所需大小组织块，Trizol一步法提取细胞中的总RNA。用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；NanoDrop 2000分光光度计测定RNA在260 nm和280 nm波长的吸光度值，评估RNA量和质量。

1.4.7 微阵列分析从总RNA中移除rRNA后，得到mRNA。使用随机引物法将每个样品放大并转录成带荧光的cRNA，标记好的cRNA在芯片上进行芯片杂交。清洗载片后，用AgilentDNAMicroarryScanner（G2505C）进行扫描。采用Agilent Feature Extraction软件采集芯片探针信号值，在Agilent GeneSpring GX软件中进行数据标准化处理和分析，得出电针组与模型组标记的信号比值（fold change），即为该基因组在电针组与模型组中的变化情况。最后经过t检验，按照fold change≥1.5，P＜0.05的标准进行筛选，得到差异表达的lncRNA和mRNA列表。对差异表达的mRNA进行基因本体GO分析，寻找表达异常的mRNA相关的生物学过程、细胞分子和疾病通路。随机选取3个lncRNA进行实时荧光定量PCR验证，以管家基因大鼠GAPDH基因为内参照，基因名称和上、下游引物序列见表1。

1.5 统计学处理数据用（x±s）表示，用SPSS 17.0统计软件进行分析处理，进行正态检验，组间比较符合正态分布进行方差分析、LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 ECG变化注射ISO后Ⅱ导联ECG上可以观察到ST段抬高，有时可见M波，并时常伴有一定程度的心律失常。干预处理后，模型组大鼠J点位移和T波振幅变化均显著高于对照组（P＜0.01），而电针组J点位移和T波振幅变化则明显低于模型组（P＜0.01），可见电针可以减轻大鼠心肌缺血程度，见表2。

表2 各组大鼠ECG比较（x±s）

2.2 lncRNA和mRNA的表达谱分析经过标准化处理，电针组与模型组比较，差异表达的lncRNA共547个，其中1.5倍以上上调的有203个，下调的有344个；差异表达的mRNA共738个，其中1.5倍以上上调的有288个，下调的有450个，见表3。部分表达异常的lncRNA和mRNA基因代码及差异倍数见表4。

表3 电针组和模型组心肌组织中差异表达lncRNA和mRNA数（个）

表4 心肌组织中部分差异表达的lncRNA和mRNA

2.3 GO分析GO分析显示差异表达的mRNA参与的生物过程，经过筛选，与心肌组织相关的生物过程主要有心肌组织发育调控、心肌细胞增值调控、心室肌细胞发育、心肌组织生长、心肌细胞增值等，富集分数最高的前10条见图1。

图1 心肌相关生物过程GO条目

2.4 实时荧光定量PCR验证与模型组比较，电针组心肌组织lncRNAs差异表达与芯片结果一致。其中，lncRNA XR_596822表达水平升高，但差异没有统计学意义（P＞0.05）；lncRNAXR_591485、lncRNA XR_597102表达水平显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2 实时荧光定量PCR验证结果

3 讨论

缺血性心脏病的主要症状为胸闷、心悸、心绞痛等，均包涵在中医的“胸痹”“心痛”“真心痛”等病证范畴中，因此古代中医多按“胸痹心痛”辨证施治。《针灸大成·卷之九治症总要》早有记载：“心胸疼痛，大陵、内关、曲泽。”2002年，世界卫生组织在《针灸临床研究报告的回顾与分析》中也肯定了冠心病是推荐针灸治疗病种之一。目前，针刺治疗心肌缺血的疗效在临床与动物实验中得到不断验证，其相关机制研究也成为中医现代化研究的一个热点。研究表明针刺治疗心肌缺血的机制可能与调节自主神经活动[5-6]、调节心肌细胞离子通道蛋白[7-8]、激活凋亡信号途径[9]等相关。近年来，基因组学技术的快速发展为针刺治疗心肌缺血的机制研究开辟了一条新思路，如通过基因芯片筛选发现，针刺内关穴对缺血心肌差异表达mRNA有良性调节趋势，且主要参与氧化磷酸化、线粒体电子传递、能量代谢等过程[10]；MicroRNA(miRNA)也可能参与了电针防治心肌缺血的过程[11]。随着新技术的发展和研究的不断深入，非编码RNA逐渐进入了人们的研究视野。

人类基因组中，非编码RNA在转录组中的含量高达98%以上，而能编码蛋白质的基因仅占1.2%，提示非编码RNA在生物体内可能具备丰富的生物学功能[12]。lncRNA就是一类细胞内源性的非编码RNA小分子，其长度超过200个核苷酸单位。lncRNA没有完整开放阅读框，不编码蛋白质，但其本身具有mRNA的特点，可被剪切和多聚腺苷酸化，从而参与表观遗传、转录及转录后水平调控基因的表达等过程[13-14]，在生理病理过程中发挥重要的调控作用[15-17]。

作为一种新的生物调控模式，lncRNA在缺血性心脏病发生发展过程扮演了重要的角色，也越来越受到研究者的关注。寻找血清相关标志物是冠心病临床研究的一大焦点。Cai等[18-19]通过临床试验比较分析了冠心病患者和正常人血浆，并采用Fisher标准建立诊断模型，发现外周血中lncRNA NONHSAT112178(LncPPARδ)和CoroMarker 2种lncRNAs，均可作为诊断冠心病的新型的血浆生物标志物。动物实验中，Zou等[20]在心肌缺血大鼠模型中发现星状神经节中lncRNA NONRATT021972明显升高，应用小干扰RNA抑制lncRNA后，血清心肌酶水平显著降低，星状神经节中P2X7蛋白表达降低，从而改善心肌缺血程度。Wang等发现一种lncRNA——自噬促成因子（autophagy-promoting factor，APF），能够与miR-188-3P和自噬相关基因7（ATG7）相互作用，影响心肌梗死程度[21]。由研究现状可见，lncRNA参与了心肌缺血的调控过程，然而有关电针对心肌缺血大鼠心肌组织lncRNA表达的影响，则鲜有报道。

本研究应用lncRNA微阵列芯片同时检测心肌缺血模型组和电针组大鼠心肌组织lncRNA和mRNA的表达水平，筛选电针治疗心肌缺血相关lncRNA。结果发现表达差异的lncRNA共547个，其中203个上调，344个下调；表达差异的mRNA共738个，其中288个上调，450个下调。提示，lncRNA的差异表达可能与电针干预有着重要联系。对差异表达mRNA进行GO分析，可以更好了解其功能。与心肌相关的生物过程，主要集中在心肌细胞发育、心肌细胞增殖等条目，提示电针干预可能通过调控心肌细胞增殖、分化调控心肌缺血过程。此外，对随机挑选出的差异表达的3个lncRNA进行实时荧光定量PCR验证，结果与芯片数据基本保持一致，提示了芯片检测的可靠性。由此，结合国内外研究，提示lncRNA在电针治疗心肌缺血过程中发挥了重要作用。

本研究从筛选差异表达lncRNA的视角对电针治疗心肌缺血相关机制进行了探究，为电针治疗心肌缺血的机制研究提供一条新线索。但要深入了解lncRNA的参与机制还需进一步结合生物信息学分析，挑选特异性lncRNA，并应用RNA干扰和基因过表达等技术进行lncRNA功能研究，以揭示电针治疗心肌缺血的分子机制。

[1]陈伟伟，高润霖，刘力生，等.中国心血管病报告2013概要[J].中国循环杂志，2014，29(7):487-491.

[2]Painovich J，Longhurst J.Integrating acupuncture into the cardiology clinic: can it playa role?[J].Acta Physiologica Sinica，2015，67(1):19-31.

[3]Ren Y，Li D，Zheng H，et al.Acupoint application in patients with chronic stableanginapectoris:studyprotocolofarandomized，double-blind，controlled trial[J].EvidBasedComplementAlternatMed，2013，2014(23):619706.

[4]栗新，曹建平，姜爱平，等.针刺结合西药治疗不稳定型心绞痛临床疗效及动态心电图观察[J].中国针灸，2015，35(9):895-896.

[5]崔帅，许静，王洁，等.电针心经腧穴对急性心肌缺血大鼠自主神经活动的影响[J].针刺研究，2016，41(6):515-520.

[6]Sa Z Y，Meng H，Zhang D，et al.The interaction of mast cells and cardiac sympathetic nerves during acupuncture in acute myocardial ischemia rats[J]. Med Acupunct，2013，25(5):343-352.

[7]Wang Y，Zhang X L，Wang W，et al.The beneficial effects of electroacupuncture at PC6(neiguan-point)ofgene and protein expressions ofclassical inward-rectifier potassium channels in myocardial ischemic rats[J]. Acupunct Eletrother Res，2015，40(4):335.

[8]WangW，Li J，MengX，et al.Effect of electronic stimulation at neiguan(PC 6)acupoint on gene expression of adenosine triphosphate-sensitive potassium channel and protein kinases in rats with myocardial ischemia[J].J Tradit Chin Med，2015，35(5):577-582.

[9]Lu SF，Huang Y，Wang N，et al.Cardioprotective effect of electroacupuncture pretreatment on myocardial ischemia/reperfusion injury via antiapoptotic signaling[J].Evid Based Complement Alternat Med，2016，2016:4609784.

[10]梁宪如，席强，李晓梅，等.针刺内关穴对急性心肌缺血大鼠缺血心肌基因表达谱的影响[J].天津中医药，2012，29(4):349-355.

[11]卢继东.“标本配穴”电针对心肌缺血大鼠细胞凋亡miRNA的影响及调控机制研究[D].湖北中医药大学，2016.

[12]Ponting C P，Belgard T G.Transcribed dark matter:meaning or myth?[J]. HumMol Genet，2010，19(R2):R162.

[13]MuersM.RNA:Genome-wideviewsoflongnon-codingRNAs[J].NatRevGenet，2011，12(11):742.

[14]Sotillo E，Thomastikhonenko A.The long reach of non-coding RNAs[J].Nat Genet，2011，43(7):616-617.

[15]Bhan A，Mandal SS.LongnoncodingRNAs:emergingstars in gene regulation，epigenetics and human disease[J].ChemMed Chem，2014，9(9):1932-1956.

[16]Lalevee S，Feil R.Long noncoding RNAs in human disease:emerging mechanisms and therapeutic strategies[J].Epigenomics，2015，7(6):877-879.

[17]Seo H，Yoon S J，Yoon J，et al.Recent trends in economic burden of acute myocardial infarction in South Korea[J].PLoSOne，2015，10(2):e0117446.

[18]Cai Y，Yang Y，Chen X，et al.Circulating"LncPPARδ"from monocytes as a novel biomarker for coronaryarterydiseases[J].Medicine，2016，95(6): e2360.

[19]Yang Y，Cai Y，Wu G，et al.Plasma long non-coding RNA，CoroMarker，a novel biomarker for diagnosis of coronary artery disease[J].Clin Sci(Lond)，2015，129(8):675-685.

[20]Zou L，Tu G，Wei X，et al.LncRNA NONRATT021972 involved the pathophysiologic processes mediated byP2X7 receptors in stellate ganglia after myocardial ischemic injury[J].Purinergic Signal，2016，12(1):127-137.

[21]Wang K，Liu C Y，Zhou L Y，et al.APF lncRNA regulates autophagy and myocardial infarction by targeting miR-188-3p[J].Nat Commun，2015，6: 6779.

Effects of Electroacupuncture on the Expression Profiles of Long Noncoding RNA and mRNA in Myocardial Tissue of Myocardial Ischemia in Rats

SA Zheyan,PAN Xiaohua,HUANG Qianru,WAN Long,ZHU Xiaoxiang,DONG Yaqin,XU Jinsen
(Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine·Key Laboratory of Propagated Sensation along Meridian of Fujian Province,Fujian Province, Fuzhou 350003,China)

Objective To explore the effect of electroacupuncture(EA)on expression profiles of long noncoding RNA of myocardial ischemia in rats.Methods 18 SD rats were randomly divided into myocardial ischemia model group,EA group and control group, with 6 rats in each group.Myocardial infarction was produced in rats with isoproterenol administered subcutaneously(sc)twice. Rats of EA group were treated with EA for 5 days.ECG in all rats were recorded.The expression profiles of lncRNA and mRNA of EA group compared with model group were analyzed through the rat lncRNA microarray.Quantitative real-time PCR was used to validate 3 selected lncRNAs.Results Voltage changes of the EA group were much lower than that of the model group.547 lncRNAs and 738 mRNA were identified to be different expression(fold change≥1.5).The results of real-time PCR were shown to be consistent with the microarray data.Conclusion Comparing with the model group,there are evidently differentially expressed profiles of lncRNA in EA group.LncRNA may play a role in the treatment of myocardial ischemia by EA.

long noncoding RNA;myocardial ischemia;electroacupuncture;Myocardial ischemia

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.061

1672-2779（2017）-16-0140-04

：李海燕本文校对：陈铭

2017-06-20）

国家自然科学基金资助课题【No.81001505】；国家自然科学基金资助课题【No.81403490】；福建省属公益类科研院所基本科研专项资助课题【No.2015R1035-14】

*通讯作者：xujinsenjls@163.com