天津株(TJM-F92)高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫后病毒血症和抗体消长规律的试验报告

杨本勇 ， 曹 东 ， 顾贵波 ， 赵晓彤 ， 赵凤菊 ， 于学武 ， 关 淼 ，李树博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁省动物医学研究院 ， 辽宁沈阳110164)

天津株(TJM-F92)高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫后病毒血症和抗体消长规律的试验报告

杨本勇 ， 曹 东 ， 顾贵波 ， 赵晓彤 ， 赵凤菊 ， 于学武 ， 关 淼 ，李树博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁省动物医学研究院 ， 辽宁沈阳110164)

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。发病主要特征为怀孕母猪流产、早产、木乃伊胎等，母猪流产率可达30%以上；仔猪出现严重的呼吸道症状，感染率可达100%，死亡率在50%以上[2-3]。目前我国使用的高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗均为活疫苗，据报道活疫苗免疫后可在动物体内复制并持续存在。为摸清高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗免疫后在猪体内的存在时间，我们进行了本试验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验猪 在某猪场选择28～30日龄、未进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征免疫的长白仔猪15头，经荧光RT-PCR检测，猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、2型圆环病毒、猪伪狂犬病病毒均为阴性，实验猪编号为A1-A15。

1.1.2 疫苗 天津株(TJM-F92株)高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，政府招标采购。

1.1.3 RT-PCR试剂 鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)高致病性强毒和致弱TJM-F92株疫苗毒的RT-PCR引物，由华威特生物科技有限公司提供，扩增片段位于NSP2基因；dNTP、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、ExTaq聚合酶等，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.4 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒 购自北京天之泰生物科技有限公司，法国LSI公司生产。

1.1.5 核酸提取试剂 核酸提取试剂盒(磁珠法)，购自西安天隆生物科技有限公司。

1.1.6 试验器材 eppendorf微量移液器，PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统，西安天隆生物科技有限公司NP968核酸提取仪，伯乐iMark酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 免疫注射 按疫苗说明书提供的免疫剂量和注射部位对试验猪进行免疫注射。

1.2.2 采血 试验猪在免疫前采血1次；免疫后每隔1周采血1次，连续采10周；以后每隔2周采血1次，连续采4次。无菌分离血清，进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒(TJM-F92株)核酸检测和抗体检测。

1.2.3 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)核酸检测 用RT-PCR方法进行检测。

1.2.3.1 核酸提取 在96孔核酸提取板的第1列孔及第7列孔中分别加入200 μL血清，10 μL Proteinase K，4 μL Acryl Carrier，然后将板放入核酸提取仪中，按说明书程序进行自动化提取。

1.2.3.2 反转录 样品RNA 5 μL，反转录引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5×Buffer 4 μL，M-MLV 1 μL，RNA酶抑制剂1 μL，DEPC水5 μL。混匀，42 ℃水浴1小时，70 ℃水浴15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液用于PCR扩增。

1.2.3.3 PCR扩增 cDNA 2 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，双蒸水13 μL。混匀后将薄壁PCR管放入PCR仪中，按如下程序扩增：首先95 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 30 s,56 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s,35个循环。最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，将PCR产物用浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压 100 V,电泳20 min。电泳结束后用凝胶成像系统观察。若扩增出约644 bp的特异性条带，则高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗毒(TJM-F92株)核酸阳性。

1.2.4 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测 按试剂盒说明书的步骤和要求操作。阻断率(IRPC)大于20%为抗体阳性，阻断率越大，抗体水平越高。

2 结果与分析

2.1 TJM-F92株疫苗核酸检测结果(表1)由表1可知，免疫前疫苗毒核酸均为阴性。在免疫后1周时有4头猪疫苗毒核酸为阳性，阳性率27%(4/15)，免疫后2周时阳性率13%(2/15)，在免疫后第3周时阳性率最高，为47%(7/15)，此后开始下降，至第6周时只有7%(1/15)。从第7周开始再没有检出阳性，表明，TJM-F92株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒的病毒血症时间最长为6周。

表1 血清中TJM-F92株疫苗毒核酸检测结果

2.2 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果 见表2。从表2可以看出，由于母源抗体的存在，免疫前抗体阳性率达到87%，免疫后抗体阳性率开始下降，至免疫后第2周时下降至33%，随后开始缓慢上升，至免疫后第3周时上至47%，第4周时升至53%，到免疫后第5周时突然上升至100%，并一致持续到第12周，随后开始稍有下降。抗体平均阻断率在免疫前也处在较高水平，达到72%，免疫后开始下降，至免疫后第2周时降至最低，只有18%，为阴性。此后开始慢慢上升，至免疫后第6周时达到最高值78%，此后开始缓慢下降。

3 讨论

3.1 从实验猪血清中TJM-F92株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒存在时间的变化规律可以看出，不同猪只病毒血症的持续时间差异较大，有的没有出现病毒血症，有的只存在1周，最长的可以达到免疫后第6周。因此TJM-F92株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后病毒血症持续时间为6周。

3.2 本试验的抗体检测结果表明，疫苗免疫后，猪体内的母源抗体会明显下降，降到合格临界值附近，这一低水平的抗体一直持续至免疫后第4周，从第5周开始疫苗免疫产生的抗体水平明显上升，至第6周时达到最高水平，并维持在一个平台到免疫后第16周，本试验的结果表明，无论仔猪的母源抗体水平高低，免疫后大约都需要经过4周左右的时间才能产生较高的抗体水平。因此免疫后的第1周至第4周抗体水平比较低，是比较危险的时期[4]。

表2 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果

3.3 比较实验猪的病毒血症阳性率与平均抗体水平的变化规律(见图1)可以发现，病毒血症的严重程度与抗体水平的高低呈负相关，即抗体水平低时，病毒血症就比较严重，随着抗体水平的不断上升，病毒血症逐渐减弱，当抗体维持在较高水平时，病毒血症消失[1]。这种现象的出现，可能是动物体内疫苗毒同抗体之间“互相斗争”的结果，疫苗免疫后刺激动物机体产生抗体，产生的抗体又不断的将活疫苗毒中和。而随着免疫时间的延长，抗体水平进一步提高，疫苗毒不断的被中和，以致无法被检测到[3]。

图1 病毒血症阳性率与平均抗体水平变化曲线

[1] 黄名英,傅安静,刘平，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期体内增殖规律调查[J].畜牧与兽医,2013,45(2):50-54.

[2] 李明义,白志娟,王莉娟，等.猪瘟灭活疫苗抗体消长规律动态研究[J].中国预防兽医学报,2005,27(5):385-388.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.2005.05.017.

[3] 魏园园，顾贵波，申冠男，等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗(JXA1-R株)免疫后病毒血症和抗体消长规律[J].中国兽医杂志，2016,52(4):44-45.

2016-04-13

辽宁省重大动物疫病病原变异与综合防控技术研究(2011214001)；高致病性猪蓝耳病综合防控与免疫净化技术推广[辽财指农(2013)1334号]

杨本勇(1973- )，男，高级兽医师，本科，从事动物疫病防控工作,E-mail：benyong@tom.com

顾贵波，E-mail：guguibo8888@126.com

S852.65+9

B

0529-6005(2017)07-0056-02